

作為目前最重要的兩種表觀遺傳學(xué)改變,DNA的5-甲基化和5-羥甲基化水平在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用。5-甲基化可以導(dǎo)致基因沉默或基因表達(dá)水平降低,因此,腫瘤抑制基因的過甲基化或原癌基因的低甲基化現(xiàn)象被發(fā)現(xiàn)存在于多種類型的腫瘤中。另外,作為去甲基化過程的第一步的5-羥甲基化則會(huì)導(dǎo)致基因激活或基因表達(dá)水平增高,并且DNA的5-羥甲基化水平在多種腫瘤中也明顯降低。因此,定量檢測(cè)分析腫瘤基因組的5-甲基化和5-羥甲基化水平具有重要的臨床意義。

四川大學(xué)華西醫(yī)院劉繼彥課題組和美國(guó)辛辛那提大學(xué)刁佳杰課題組綜述了可用于定量檢測(cè)腫瘤基因的5-甲基化和5-羥甲基化水平的單分子測(cè)序技術(shù),包括納米孔測(cè)序技術(shù)、單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)、單分子光學(xué)圖譜技術(shù)及單分子熒光成像技術(shù)。該文發(fā)表在VIEW上(DOI:10.1002/viw2.9)。
用于定量分析5-甲基化和5-羥甲基化水平的技術(shù)中,單分子測(cè)序技術(shù)以其較高的敏感性吸引了研究者們的注意。四川大學(xué)華西醫(yī)院劉繼彥課題組和美國(guó)辛辛那提大學(xué)刁佳杰課題組總結(jié)了目前的單分子測(cè)序技術(shù),并基于檢測(cè)信號(hào)的類型將單分子測(cè)序分為了兩大類,分別是基于電學(xué)信號(hào)的納米孔測(cè)序技術(shù),和基于光學(xué)信號(hào)的單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)、單分子光學(xué)圖譜技術(shù)及單分子熒光成像技術(shù)。納米孔技術(shù)是通過檢測(cè)5-甲基化胞嘧啶或5羥甲基化胞嘧啶通過納米孔時(shí),導(dǎo)致納米孔關(guān)閉,從而導(dǎo)致的電流變化的不同來定量分析單鏈DNA分子中的5-甲基化或5羥甲基化水平的(圖a),納米孔測(cè)序技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于不需要對(duì)樣本進(jìn)行標(biāo)記和擴(kuò)增。在單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù),需要首先將用于檢測(cè)DNA序列的單個(gè)核苷酸分子標(biāo)記上熒光基團(tuán),然后以樣本單鏈DNA為模板,通過分析雙鏈DNA合成過程中發(fā)出的不同熒光脈沖信號(hào)來檢測(cè)模板DNA單鏈的序列,同時(shí)根據(jù)動(dòng)力學(xué)信息,可以將模板DNA單鏈中的胞嘧啶堿基和5-甲基化或5羥甲基化的胞嘧啶堿基區(qū)分開(圖b)。單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于其讀長(zhǎng)長(zhǎng)度可達(dá)到1.5kb。單分子光學(xué)圖譜技術(shù)則是首先將樣本DNA的5-甲基化胞嘧啶或5-羥甲基化胞嘧啶標(biāo)記上熒光基團(tuán),然后通過熒光顯微鏡觀察單鏈DNA分子通過納米槽時(shí)形成的熒光代碼信號(hào)來定量分析DNA的5-甲基化或5-羥甲基化水平(圖c)。單分子熒光成像技術(shù)也是通過將DNA的5-甲基化胞嘧啶和5-羥甲基化胞嘧啶標(biāo)記上熒光基團(tuán),然后進(jìn)一步通過全內(nèi)反射熒光顯微鏡來獲得DNA的5-甲基化或5-羥甲基化水平信息(圖d)。單分子光學(xué)圖譜技術(shù)和單分子熒光成像技術(shù)的優(yōu)勢(shì)都在于并不需要復(fù)雜的后期數(shù)據(jù)處理,就可以很直觀的獲得DNA的5-甲基化或5-羥甲基化的定量信息。并且,單分子熒光成像技術(shù)還可以進(jìn)一步獲得DNA分子中5-甲基化和5-羥甲基化兩者之間的位置的信息。
研究者相信,由于光學(xué)檢測(cè)技術(shù)和電學(xué)檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展,單分子測(cè)序技術(shù)也終將取得更大的發(fā)展。另外,將不同原理的單分子測(cè)序技術(shù)整合或者將單分子測(cè)序技術(shù)與傳統(tǒng)的測(cè)序技術(shù)聯(lián)合,取長(zhǎng)補(bǔ)短,也會(huì)是未來單分子測(cè)序技術(shù)發(fā)展的新方向。
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https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/viw2.9
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