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第四章 分子病理檢測技術(shù)及產(chǎn)品的發(fā)展
概述
外科腫瘤病理學(xué)發(fā)源于19世紀(jì)后葉的歐洲。隨著當(dāng)時外科手術(shù)學(xué)的發(fā)展，外科醫(yī)生們開始開展腫瘤術(shù)前活檢，并把它做為一項必需的診斷手段。到19世紀(jì)90年代，冰凍切片技術(shù)的發(fā)明使術(shù)中活檢成為可能，更進一步推動了外科腫瘤病理學(xué)的發(fā)展。到20世紀(jì)末，外科病理學(xué)的發(fā)展主要經(jīng)歷了兩座里程碑：20世紀(jì)30年代，電鏡的發(fā)明使病理醫(yī)生能夠觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。20世紀(jì)50年代，免疫組織化學(xué)技術(shù)被應(yīng)用于診斷病理學(xué)，使病理醫(yī)生能進一步觀察細(xì)胞，特別是細(xì)胞的起源。20世紀(jì)70年代初，隨著細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展,病理學(xué)與上述學(xué)科相互滲透而形成了新的分支學(xué)科-分子病理學(xué)，由于其在蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子水平上，應(yīng)用分子生物學(xué)理論，技術(shù)及方法研究疾病發(fā)生發(fā)展的過程，從而給傳統(tǒng)病理學(xué)注入了生機。分子病理是傳統(tǒng)病理的補充和延伸，是分子生物學(xué)技術(shù)與腫瘤病理診斷相結(jié)合的產(chǎn)物�？上攵臋z查范圍很廣，并且隨著分子生物學(xué)技術(shù)的更新而在不斷的改進中。下面就幾種常用檢測手段具體展開討論。
第一節(jié) 染色體分析
染色體組型分析是細(xì)胞遺傳學(xué)研究的基本方法，是研究物種演化、分類以及染色體結(jié)構(gòu)、形態(tài)與功能之間關(guān)系所不可缺少的重要手段。通過染色體核型分析，可以根據(jù)染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目的變異情況來判斷生物是否患有某種因染色體片段缺失、重復(fù)或倒置等引起的遺傳病。
越來越多的腫瘤，特別是骨關(guān)節(jié)、軟組織和淋巴造血系統(tǒng)的腫瘤，已被發(fā)現(xiàn)有特異的染色體異常。所以對腫瘤細(xì)胞的染色體分析在很多時候成為診斷這些腫瘤的金標(biāo)準(zhǔn)。比如說，70%～95%的濾泡型淋巴瘤有特異性的14號染色體與18號染色體的易位。WHO制定的惡性血液病分型系統(tǒng)中，將染色體核型作為最重要的分型及診斷指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)重現(xiàn)性異常的染色體可提前作出AML的診斷。很多染色體異常導(dǎo)致特異性的白血病融合基因。染色體分析除用于各類惡性血液病患者，如急、慢性白血病、MDS、MPNs、淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤(MM)患者外，還可用于兒童遺傳性疾病、先天性畸形的染色體檢測，以及習(xí)慣性流產(chǎn)、不孕不育等疾病的診斷。
染色體核型分析技術(shù)，傳統(tǒng)上是觀察染色體形態(tài)。但隨著新技術(shù)的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用，染色體核型分析變得越來越現(xiàn)代化，很多軟件系統(tǒng)的完善也使核型分析結(jié)果越來越精確。染色體核型分析三大技術(shù)包括：GRQ帶技術(shù)、熒光原位雜交技術(shù)、光譜核型分析技術(shù)。
1.GRQ帶技術(shù)
人類染色體用Giemsa染料染色呈均質(zhì)狀，但是如果染色體經(jīng)過變性和(或)酶消化等不同處理后，再染色可呈現(xiàn)一系列深淺交替的帶紋，這些帶紋圖形稱為染色體帶型。顯帶技術(shù)就是通過特殊的染色方法使染色體的不同區(qū)域著色，使染色體在光鏡下呈現(xiàn)出明暗相間的帶紋。每個染色體都有特定的帶紋,甚至每個染色體的長臂和短臂都有特異性。根據(jù)染色體的不同帶型，可以更細(xì)致而可靠地識別染色體的個性。染色體特定的帶型發(fā)生變化，則表示該染色體的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。一般染色體顯帶技術(shù)有G顯帶(最常用)，Q顯帶和R顯帶等。G帶技術(shù)是其中最常用的技術(shù) ,由Pardue等人于1970年建立，G帶反應(yīng)了染色體DNA上AT的豐富區(qū)，在人類中約有2000條G帶可被鑒別。G帶不僅穩(wěn)定且用掃描電鏡可在帶區(qū)見到收縮的痕跡。現(xiàn)在已制成人類的G帶標(biāo)準(zhǔn)圖譜,可用于鑒定染色體號數(shù)以及基因定位。Q帶是在 1968年由 Caspersson等人建立的。R帶是和 G帶相反的帶，也就是反帶的意思，這種方法由Dutrillaux等人1971年建立。
2.熒光原位雜交技術(shù)
熒光原位雜交(fluorescence insitu hybridization, FISH)是在20世紀(jì)80年代末在放射性原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種非放射性分子細(xì)胞遺傳技術(shù)，以熒光標(biāo)記取代同位素標(biāo)記而形成的一種新的原位雜交方法，探針首先與某種介導(dǎo)分子結(jié)合，雜交后再通過免疫細(xì)胞化學(xué)過程連接上熒光染料。最早應(yīng)用熒光原位雜交是在 1980 年 ,當(dāng)時直接用熒光在 RNA 3′端標(biāo)記，作為探針來檢測特定 DNA 序列。聯(lián)合氨基基質(zhì)，能夠耦聯(lián)任何半抗原或者熒光團。用簡單的化學(xué)分析就可以檢測低信號探針，這對原位技術(shù)的發(fā)展很重要。探針的特異性，影響了FISH中低拷貝數(shù)量核酸的檢測。間接標(biāo)記雜交探針，可以使非直接檢測的信號放大。在20世紀(jì)80年代初期，用生物素標(biāo)記探針，然后用鏈球菌抗生物素蛋白熒光素級聯(lián)放大檢測DNA。大約10年之后，含有大量熒光分子的雜交探針經(jīng)化學(xué)處理后，可以進行直接檢測。20世紀(jì) 90年代，為同時檢測更多的種類，科研工作者開辟了新的研究方向。起初，運用的是成像顯著的光譜熒光團，后來人們開始用兩種編碼方法來改進它：特定核酸可以用二元顏色化合物來鑒定。這樣每個染色體、基因或者轉(zhuǎn)錄過程就被截然不同的熒光信號所表示；使用比率相同的編碼，用同一種顏色的混合物，依據(jù)對全部信號每一種顏色的相對變化，來描繪多種靶目標(biāo)。采用一種方法和同時用兩種一樣，已經(jīng)提高了許多核酸同時檢測的數(shù)量 。
FISH作為定位特定核酸序列的檢測方法 ,在過去的20年里不斷發(fā)展。其初期的發(fā)展是擴大探針的種類和靶目標(biāo)的數(shù)量，今后熒光技術(shù)的發(fā)展是擴展研究學(xué)科的種類。由于涉及很多領(lǐng)域，操作容易以及相關(guān)學(xué)科知識的快速增長，所以 FISH的使用非常廣泛。雖然基本操作沒有改變，但是高敏感檢測、多種類檢測、自動化數(shù)據(jù)收集分析技術(shù)的提高，很大 程度地促進了該技術(shù)的發(fā)展。它已經(jīng)成為一項先進的生物學(xué)技術(shù)。當(dāng)前，科研人員掌握了低噪聲雜交探針的制備，能在更廣闊的研究領(lǐng)域中運用它。
3.光譜核型分析技術(shù)
SKY(spectralkaryotying)光譜染色體自動核型分析是一項顯微圖像處理技術(shù)，SKY通過光譜干涉儀,由高品質(zhì)CCD獲取每一個像素的干涉圖像，形成一個三維的數(shù)據(jù)庫并得到每個像素的光程差與強度間的對應(yīng)曲線，該曲線經(jīng)傅立葉變換之后得到該像素的光譜，再經(jīng)由軟件分析之后用分類色來顯示圖像或?qū)⒐庾V數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的紅綠藍信號后以常規(guī)方式顯示。24種全染色體涂染探針先用5種不同的熒光素組合進行不同的標(biāo)記，然后將探針混合物與中期染色體進行原位雜交，通過熒光顯微鏡獲得熒光圖像進行光譜成像。其結(jié)果分為顯色成像和分色成像兩部分。前者可于圖像獲取后即刻評估所有探針的雜交質(zhì)量，后者用特定的SKY軟件參照每一條染色體特有的光譜信息特征進行分析。在染色體核型排序chromosome karyotyping的應(yīng)用上，SKY可同時分辨人類的22對染色體及X、Y性染色體或老鼠的21種不同染色體，并以各種顏色呈現(xiàn)出來。SKY技術(shù)不同于M- FISH染色體核型技術(shù)，后者需由6個或更多的熒光濾鏡組來分別取各個顏色的熒光的圖像，然后再將所有圖像層層堆疊，流程繁瑣且信號之間會互相干擾。SKY能做到用一組熒光濾鏡，做一次雜交反應(yīng)，便可得到全部染色體的自動核型定序。傳統(tǒng)的利用GRQ或DAPIbanding常常無法就染色體結(jié)構(gòu)上的細(xì)微變異，特別是發(fā)生在染色體末端的變化做出準(zhǔn)確的判斷，尤其是當(dāng)基因體變異發(fā)生在G帶極為相似的染色體片段時，只有靠頻譜分析才能做出快速而準(zhǔn)確的診斷。頻譜分析的另一個優(yōu)點是仍然支持傳統(tǒng)的G帶或DAPI帶為基礎(chǔ)的染色體核型定序。SKY具有高光透過量和高精確度。SKY能發(fā)現(xiàn)經(jīng)典遺傳技術(shù)及單獨使用FISH技術(shù)所不能發(fā)現(xiàn)的細(xì)微的染色體異常，清楚地鑒別染色體重排，特別是易位、插入及可能產(chǎn)生標(biāo)記染色體的來源也一目了然。
第二節(jié) 測序
測序是對核酸分子的核苷酸排列順序的測定，也就是測定組成核酸分子的核苷酸A、T、G、C的排列順序。測序用于測定未知DNA序列，確定重組DNA的方向與結(jié)構(gòu)，對突變進行定位和鑒定、比較研究，是生命科學(xué)研究最重要、最常用的技術(shù)手段之一�？梢哉f，有基因的地方就有測序。正因為DNA測序的普及化，帶動了一批為測序提供商業(yè)化技術(shù)服務(wù)的生物技術(shù)企業(yè)，形成了一個新興的測序行業(yè)。
測序正處在技術(shù)上日新月異的時代，其突出特點是，測序通量（測序數(shù)據(jù)量）的大幅增長，原始數(shù)據(jù)中每個堿基的測序成本急劇下跌，并伴隨著以巨資購買儀器以引進新技術(shù)的需求。以前看似高不可攀的奢侈性研究活動（如個人基因組測序，宏基因組學(xué)研究，以及對大量重要物種的測序），在近三十年間年之間，測序技術(shù)由一代發(fā)展到了三代四代測序技術(shù)，隨著2001年完成人類基因組框架圖，此后基因測序開始進入發(fā)展期，以急速的步伐而變得越來越切實可行。
1.一代測序／直接測序
第一代DNA測序技術(shù)最初泛指1975年由桑格（Sanger）和考爾森（Coulson）開創(chuàng)的鏈終止法和1976-1977年由馬克西姆（Maxam）和吉爾伯特（Gilbert）發(fā)明的化學(xué)法（鏈降解）。后來由于Sanger方法的簡便易行，逐漸占據(jù)了主導(dǎo)地位，一代測序也可以稱為Sanger測序。在1977年，Sanger測定了第一個基因組序列--噬菌體X174，全長5375個堿基。后來的四色熒光桑格測序法（每一種熒光代表四種堿基中的一種）被用在自動毛細(xì)管電泳測序系統(tǒng)中，此系統(tǒng)由應(yīng)用生物系統(tǒng)有限公司（AppliedBiosystemsInc）推上市場，后來該公司被整合入生命技術(shù)公司（LifeTechnologies）和貝克曼考爾特公司（BeckmanCoulterinc）。
發(fā)表于2001年的第一個人類基因組復(fù)合序列就是大體上由細(xì)管電泳測序系統(tǒng)來測定完成的，不僅耗資龐大，花費人力無數(shù)，而且歷時超過十年。盡管發(fā)表于2001年的基因組仍然處于有待完善的過程中，但其作為基因組的"參照"序列而被采用，已成為生命科學(xué)轉(zhuǎn)化為實際應(yīng)用的基礎(chǔ)，并繼續(xù)對研究基因型-表現(xiàn)型的關(guān)系發(fā)揮著重要作用。從迄今為止發(fā)表的（和未發(fā)表的）文獻報道來看，要對人類復(fù)雜疾病進深入的有醫(yī)療意義的探討，非常有必要去獲得其他類型的"個人"基因組數(shù)據(jù)，如，特定組織mRNA表達概況、mRNA測序、基因調(diào)控區(qū)域的個性化分析、表觀遺傳調(diào)控的概況，以高質(zhì)量和大范圍的染色體圖譜分析來歸類重要的染色體刪缺、插入和重排等等。大規(guī)模測序中心正完成新一代的測序儀器的轉(zhuǎn)型，聯(lián)合基因組研究所（theJointGenomeInstituteJGI）已經(jīng)淘汰了所有的Sanger測序儀。而另一方面，除非小型的第二代測序儀能在清楚讀出每個堿基上的成本和測序讀長上勝過毛細(xì)管電泳測序系統(tǒng)，毛細(xì)管測序系統(tǒng)仍將會大量應(yīng)用于特定區(qū)域測序，如定量基因表達、生物標(biāo)志物鑒定和生物學(xué)途徑分析等專向性研究。
圖1：DNA測序流程圖（sanger法）
2．第二代測序技術(shù)
第二代技術(shù)定義為是同步化三磷酸核苷酸的洗脫方法和同步化的光學(xué)檢測方法的結(jié)合。但這種定義不是很嚴(yán)格，因為有幾種算作是第三代測序的實時合成測序的方法，也依賴于光學(xué)檢測，如太平洋生物科學(xué)公司（PacificBiosciences）的單DNA聚合酶測序法就是突出例子。第二代測序技術(shù)靠的是連接測序或者合成測序，包括焦磷酸測序和可逆性的鏈終止法。由羅氏（Roche）、以魯米那（Illumina）、赫利克斯（Helicos）和生命技術(shù)公司（LifeTechnologies）以商業(yè)化提供的儀器，以短的連續(xù)性的片段序列和測序閱讀長度的形式，每周輸出數(shù)十億堿基對的DNA序列。
圖2：DNA測序技術(shù)比較
在新型DNA測序技術(shù)領(lǐng)域里，各種技術(shù)和資助以從未有過的速度在增長，出現(xiàn)了很多不同的方法，橫跨不同代的新技術(shù)。每種技術(shù)都有自身的優(yōu)勢和局限，因此，從根本上說，要做特定目的的基因分析應(yīng)用，必須進行合理評估，以選擇合適的測序平臺。
雖然第二代和第三代平臺有很大的通量，但基于Sanger原理的毛細(xì)管電泳測序仍是超高精度測序的黃金標(biāo)準(zhǔn)，是迄今為止唯一既能為人類基因組既提供從頭測序和又有從頭組裝技術(shù)的技術(shù)。下一代測序技術(shù)為了獲得廣泛認(rèn)同，無論是第二或第三代平臺中的哪一種，都必須也同時具備一套第一代毛細(xì)管電泳測序平臺，并同時將由這兩套平臺得到的從頭測序樣品的測序結(jié)果和組裝結(jié)果進行定量比較，方能使人放心而得到廣泛的認(rèn)同。
換言之，無論第二、三代測序平臺怎樣發(fā)展，它們?nèi)匀灰蕾囉诘谝淮脚_的協(xié)助作用。這將為從頭測序的真實成本提供堅實的證據(jù)，并作為一個出發(fā)點，供現(xiàn)在和將來的研究人員去決定如何解決下一波的人類基因組測序計劃，或?qū)Q定如何開展對一些相似的復(fù)雜基因組進行從頭測序。目前，既然現(xiàn)有的測序技術(shù)局各有其局限性，為了達到對一種復(fù)雜的全基因組進行從頭測序，可能需要隨機采用幾種技術(shù)，彼此協(xié)調(diào)配合，以達到測序的高通量，準(zhǔn)確性、高讀長的相鄰重疊片段和大范圍的基因繪圖。
近幾年來，我國DNA測序市場火速發(fā)展，以華大基因、生工生物等為龍頭的測序類公司均實現(xiàn)100%以上的復(fù)合增長；2007-2010年4年間，我國DNA測序的收入每年以200%的速度增長，2009年收入達到3.6億元，2010年突破7億元�；驕y序領(lǐng)域大致分為設(shè)備、測序與應(yīng)用這三大塊，其中有含金量的是測序設(shè)備的研發(fā)與臨床應(yīng)用的開發(fā)。目前，測序儀市場主要被國外公司所占據(jù)。Illumina擁有測序市場最大的份額，與羅氏、美國生命科技公司等幾大公司壟斷了整個測序儀市場，而提供測序服務(wù)的企業(yè)必須購買測序儀，沒有其他的任何替代品，因而提供測序服務(wù)的公司對其議價能力較低。以華大基因為例，華大基因于2010年購買了128臺Illumina公司的新測序儀HiSeq2000，每臺價格69萬美元，如此大規(guī)模的購買，仍然是依從Illumina的定價。隨著測序產(chǎn)業(yè)在臨床上的應(yīng)用越來越廣泛，期待會有國產(chǎn)測序儀器占據(jù)市場份額。
第三節(jié) 核酸雜交
核酸分子雜交技術(shù)是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的一種分子生物學(xué)技術(shù)。它是基于DNA分子堿基互補配對原理，用特異性的核酸探針與待測樣品的DNA/RNA形成雜交分子的過程。分子雜交實驗依據(jù)其形式的不同可以分為液相雜交、固相雜交、原位雜交，而固相雜交又可以分為菌落雜交、點/狹縫雜交、Southern印跡雜交和Northern印跡雜交。各類型雜交的基本原理和步驟是基本相同的，只是選用的雜交原材料、點樣方法有所不同。原位雜交是應(yīng)用核酸探針與組織或細(xì)胞中的核酸按堿基配對原則進行特異性結(jié)合形成雜交體，然后應(yīng)用組織化學(xué)或免疫組織化學(xué)方法在顯微鏡下進行細(xì)胞內(nèi)定位或基因表達的檢測技術(shù)。其中在此技術(shù)上發(fā)展的熒光原位雜交（FISH）技術(shù)因其經(jīng)濟、安全、快速、簡便、靈敏度高等，在發(fā)育生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和病理學(xué)研究上均得到廣泛的應(yīng)用。近 年來，圍繞提高檢測的分辨率和靈敏性，不斷將免疫染色、量子點和微流控芯片等物理化學(xué)技術(shù)引入到熒光原 位雜交中，促進了它的快速發(fā)展。
熒光原位雜交技術(shù)是根據(jù)核酸堿基互補配對原理，用半抗原標(biāo)記 DNA 或者 RNA 探針與經(jīng)過變性的單鏈核酸序列互補配對，通過帶有熒光基團的抗體去識別半抗原進行檢測，或者用熒光基團對探針進行直接標(biāo)記并與目標(biāo)序列結(jié)合，最后利用熒光顯微鏡直接觀察目標(biāo)序列在細(xì)胞核、染色體或切片組織中的分布情況。FISH 技術(shù)發(fā)展早期，是應(yīng)用放射性同位素標(biāo)記探針來定位目標(biāo)序列的，直到 1980 年 Bauman 等才將熒光染料直接標(biāo)記 RNA探針的3’端，并檢測到了特異的 DNA；1982年Manuelidis 等采用生物素標(biāo)記的探針進行了染色體原位雜交。然而由于植物細(xì)胞中細(xì)胞壁的存在，非放射性生物素標(biāo)記探針技術(shù)直到 1985 年才首次應(yīng)用于黑麥中 120 bp 重復(fù)序列在小麥染色體上的分布研究。因熒光原位雜交技術(shù)克服了放射性探針檢測周期長且危害人體健康的缺點，被廣泛應(yīng)用于基因定位、染色體識別、物理圖譜的構(gòu)建、進化分析等研究中。FISH 技術(shù)常用的半抗原標(biāo)記物有生物素和地高辛，檢測的熒光基團有異硫氰酸熒光素( fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC) 、花菁染料( cyaninedye) 和羅丹明( rhodamine) 等。
衡量FISH技術(shù)兩個最重要的參數(shù)是分辨率和靈敏度。FISH技術(shù)從誕生發(fā)展至今已有30多年的歷史，期間主要是通過改良靶標(biāo)序列和探針種類來不斷提高其分辨率和靈敏度的。隨著 FISH 技術(shù)的不斷完善與發(fā)展，已被廣泛 應(yīng)用于 DNA 序列或基因的定位、核型分析、基因組進化研究、物理圖譜的構(gòu)建、轉(zhuǎn)基因生物的鑒定 等。在FISH 基礎(chǔ)上發(fā)展起來的多色熒光原位雜交 ( multiplex-FISH，M-FISH) ，可通過多色熒光同時 探測多個目標(biāo)，如用不同顏色的探針組合來識別人類的24條染色體。繼而在M-FISH的基礎(chǔ)上又發(fā)展了比較基因組原位雜交( comparative genomic hybridization，CGH) 和三維熒光原位雜交( three- dimensional FISH，3D-FISH) 技術(shù)。比較基因組原位雜交將供試材料和對照組材料的DNA用不同顏色的熒光基團進行標(biāo)記，同時在對照組的染色體上進行雜交，根據(jù)產(chǎn)生顏色的差異來判斷兩個基因組相對DNA拷貝數(shù)的變化，并將其定位到染色體上。根據(jù)CGH-FISH的檢測分辨原理，發(fā)展了CGH芯片技術(shù)和SNP( single nucleotide polymor- phism)芯片技術(shù)，然后進行數(shù)字化信號采集，使FISH變成了高通量的檢測技術(shù)。
1.免疫-熒光原位雜交技術(shù)
免疫染色( immunostaining) 是生物化學(xué)中任何基于抗體來檢測樣品中特定蛋白質(zhì)方法的總稱。免疫染色最初是指組織切片的免疫組化染色，由Coons首先提出的，目前免疫染色已涵蓋了組織學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)中所應(yīng)用的諸多基于抗體的染色技術(shù)。免疫染色和熒光原位雜交技術(shù)相結(jié)合( immuno-FISH) 可用來分析單細(xì)胞或者單個染色體水平上的特定序列與其相關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的關(guān)系，拓展了熒光原位雜交技術(shù)的應(yīng)用范圍，并且可以作為染色質(zhì)免疫共沉淀結(jié)合的測序技術(shù) ( chromatin immunoprecitation-sequencing，ChIP- seq) 或結(jié)合DNA微陣列技術(shù)( ChIP-chip) 的一個互補方法。由于染色質(zhì) 免疫共沉淀結(jié)合的測序技術(shù)或DNA微陣列技術(shù)不能辨別處在細(xì)胞周期不同階段的細(xì)胞，這樣獲得的數(shù)據(jù)只能代表一些基因不同表達模式的細(xì)胞群體或處于不同細(xì)胞周期的細(xì)胞群體所產(chǎn)生的平均值。免疫染色結(jié)合的熒光原位雜交技術(shù)可以檢測某一時期單細(xì)胞水平的某一DNA序列和與之相關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)關(guān)系及其分布情況，這樣有利于消除細(xì)胞間的差異性。
Immuno- FISH 還可用來檢測特定區(qū)域的組蛋白修飾情況，如Zinner等利用三維技術(shù)分析了不同染色體組蛋白修飾的差異; Zhang等檢測了rDNA重復(fù)序列區(qū)域組蛋白修飾的分布情況。免疫染色還可以和fiber-FISH相結(jié)合，檢測被拉伸的染色質(zhì)區(qū)域一些序列和相關(guān)蛋白的關(guān)系，大大提高了檢測的分辨率。Jin等利用免疫染色和fiber-FISH檢測了著絲粒序列和著絲粒蛋白的關(guān)系。近年來，Immuno-FISH在研究表觀遺傳學(xué)、細(xì)胞分裂以及探討染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)與基因表達的關(guān)系等方面發(fā)揮了重要的作用。
2.量子點-熒光原位雜交技術(shù)
量子點( quantum dot，QD) ，又名半導(dǎo)體納米晶體，具有獨特的光化學(xué)和物理性質(zhì)，已被廣泛應(yīng)用于免疫組化、細(xì)胞追蹤、活體成像、流式細(xì)胞術(shù)和熒光原位雜交技術(shù)等。與傳統(tǒng)有機熒光標(biāo)記物相比，量子點具有很多優(yōu)點，如量子點的激發(fā)光波長范圍寬，而發(fā)射光波長范圍窄，可以在一個激發(fā)光下觀察到多個不同的量子點標(biāo)記物; 通過調(diào)節(jié)量子點的大小和組成，得到不同發(fā)射光譜的量子點，適用于多色標(biāo)記; 量子點的熒光強度強，不易發(fā)生光淬滅等。
熒光原位雜交技術(shù)一般采用有機熒光染料來檢測雜交信號，但是有機熒光基團容易發(fā)生淬滅，而且發(fā)射光波長范圍寬，做多色雜交并在不同激發(fā)光下觀察時，很容易串色。將量子點引入到熒光原位雜交體系中，不但可以解決這些問題，而且還大大提高了FISH檢測的靈敏度。QD-FISH常通過兩種方法來實現(xiàn): 一是間接標(biāo)記法，即使用鏈霉親和素-量子點偶聯(lián)物來檢測生物素標(biāo)記的探針，目前市場上已有商業(yè)化的試劑盒出售; 二是直接標(biāo)記法，即使用量子點直接標(biāo)記探針。盡管QD-FISH技術(shù)還不是很成熟，但還是有一些應(yīng)用研究報道。Xiao和Barker 首先將鏈霉親合素偶聯(lián)的量子點應(yīng)用到檢測人類中期染色體上的熒光原位雜交信號，并且證明量子點比傳統(tǒng)的有機熒光染料更耐光漂；Wu等使用合成的巰基乙酸量子點標(biāo)記的DNA應(yīng)用于大腸桿菌的熒光原位雜交。隨著QD- FISH技術(shù)的改進與成熟，量子點作為一種新穎的熒光染料，將會進一步推動分子病理的發(fā)展。
3.微流控芯片-熒光原位雜交技術(shù)
微流控芯片( microfluidic chip) 技術(shù)是把醫(yī)學(xué)、生物、化學(xué)等分析過程中的樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測等步驟集成到一塊納米級的芯片上，稱為“芯片實驗室”( lab on a chip) 。整個過程可通過計算機操作，具有液體流動可控性、所需樣品和試 劑量較少、反應(yīng)時間短等特點，而且還可以自動化進行大規(guī)模的樣品分析。而傳統(tǒng)的熒光原位雜交中探針的價格十分昂貴，且雜交的整個操作過程繁瑣、耗時長， 限制了FISH技術(shù)的廣泛應(yīng)用。將微流控芯片與熒光原位雜交相結(jié)合( FISH on microchip) ，可以避免這些缺點，并將雜交檢測的時間縮短到傳統(tǒng)熒光原位雜交所需時間的1 /20，而試劑量僅為原來的1 /10，大大降低了成本，并且可以自動化一次分析多個樣本。此 外，在微流控芯片的平臺上，免疫染色-熒光原位雜交技術(shù)和量子點-熒光原位雜交技術(shù)都是可以實現(xiàn)的，并且還可以大大提高檢測效率和靈敏度。
第四節(jié) PCR
PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法，故又稱為基因的體外擴增。PCR技術(shù)具有特異性強、快速、簡便等優(yōu)點，能在短時間內(nèi)將所要的目的基因擴增至數(shù)萬倍，擴增的過程類似于DNA的復(fù)制過程，其特異性依賴于靶序列兩端的寡核苷酸引物，并且可通過基因的擴增獲得目的片段。
PCR技術(shù)誕生于20世紀(jì)80年代，1983年底12月16日K. Mullis第一次成功實驗發(fā)明了PCR，1985年《Science》上首次發(fā)表關(guān)于PCR 的文章。1987 Cetus公司在美國獲得PCR基本技術(shù)的專利批準(zhǔn)。1989《Science》報道了耐熱性DNA多聚酶Taq酶的發(fā)現(xiàn)，預(yù)示著分子時代的到來。Kary Mullis于1993年因PCR的發(fā)明獲得了諾貝爾化學(xué)獎。國內(nèi)全面開展PCR技術(shù)并應(yīng)用于臨川是在90年代中期。1998年實時熒光PCR技術(shù)開始在中國較廣泛的應(yīng)用于臨床檢測；次年西方發(fā)達國家嘗試將PCR應(yīng)用于血液篩查。
PCR技術(shù)最大的特點是能不斷的推出新的形式，其衍生技術(shù)如：反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)、實時熒光定量PCR、多重PCR及巢式PCR等已廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)療領(lǐng)域，如：疾病基因檢測、遺傳病的產(chǎn)前診斷、致病病原體的檢測、腫瘤個體化治療的基因檢測、DNA指紋、個體識別、親子關(guān)系鑒別、法醫(yī)物證以及動、植物檢疫等等。
PCR技術(shù)根據(jù)用途不同可分為普通PCR類和定量PCR類。普通PCR適用于定性分析，富集克隆目的基因片段，其產(chǎn)物一般在100bp到數(shù)kb不等，是很多衍生技術(shù)的基礎(chǔ)。定量PCR是在普通PCR的基礎(chǔ)上加入熒光染料或用有熒光標(biāo)記的探針實時監(jiān)控DNA的含量變化以對模版中的DNA進行定量分析（絕對定量與相對定量）。熒光定量PCR是目前在臨床中應(yīng)用最為廣泛的PCR技術(shù)，也是目前對臨床診斷影響最深遠的分子診斷技術(shù)，主要包括：ARMS法熒光定量PCR技術(shù)、染料法熒光定量PCR技術(shù)、Taqman探針法熒光定量PCR技術(shù)及數(shù)字PCR技術(shù)等。
1.染料法熒光定量PCR技術(shù)
熒光染料能結(jié)合在DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的小溝中，而游離的熒光染料不發(fā)出熒光，因此擴增開始時檢測不到熒光信號。隨著擴增的進行，熒光染料與逐漸增多的dsDNA結(jié)合，熒光強度逐漸增強，直到達到閾值，被熒光探測系統(tǒng)檢測到。通過對已知拷貝數(shù)，不同稀釋倍數(shù)的陽性模板做熒光定量PCR，即可做出標(biāo)準(zhǔn)曲線。未知樣品通過與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，即可得出定性和定量的結(jié)果。在反應(yīng)體系中，其信號強度即代表了雙鏈 DNA 分子的數(shù)量。研究中常用染料有Pico Green和SYBR Green。Pico Green是一種新型的染料，與SYBR Green相比，其靈敏度較高，可以檢測出至少25 pg·mL-1 的dsDNA 分子，且具有線性范圍廣，RNA、ssDNA及其他物質(zhì)的影響小的優(yōu)點。熒光染料法其優(yōu)勢在于檢測方法簡便，檢測成本低。不足之處是由于染料與DNA雙鏈分子的結(jié)合是非特異性的，它可以和反應(yīng)體系中的所有DNA分子結(jié)合，因此易受到非特異性擴增和引物二聚體的影響，使定量結(jié)果不可靠。所以，其特異性不如探針法。針對這一問題可以借助融解曲線（HRM）分析法來區(qū)分非特異性產(chǎn)物和引物二聚體而排除假陽性。此外，也可以通過設(shè)計特異性引物、優(yōu)化PCR的反應(yīng)條件，減少或去除非特異性產(chǎn)物和引物二聚體的產(chǎn)生以提高特異性進行定性診斷。
2.探針法熒光定量PCR技術(shù)
TaqMan探針是應(yīng)用最廣的水解探針，其原理主要是在PCR反應(yīng)體系加入一個特異的熒光標(biāo)記探針，根據(jù)FRET原理，當(dāng)探針保持完整時，3'端淬滅基團抵消了5'端發(fā)射基團的熒光發(fā)射，這時檢測不到熒光信號。在PCR的退火期，探針與模板發(fā)生特異性雜交，當(dāng)延伸期引物在Taq 酶作用下沿DNA模板延伸到達探針處，由于所用Taq酶具有 5'→3' 外切活性，發(fā)生置換反應(yīng)，使 5'端標(biāo)記熒光發(fā)射基團FAM(6-羧基熒光素)與3'端標(biāo)記熒光淬滅基團TAMRA(6-羧基四甲基若丹明)分離，熒光信號得到釋放，這時熒光探測系統(tǒng)就能檢測到光密度的增加。模板每復(fù)制1次，就有1個探針被切斷，伴隨著1個熒光信號被釋放。由于理論上被釋放的熒光基團數(shù)和PCR產(chǎn)物數(shù)是一對一的關(guān)系，因此根據(jù)PCR反應(yīng)液中的熒光強度即可計算出初始模板的數(shù)量。
分子信標(biāo)，由Tyagi 和Krammer 建立。該種探針是一段莖環(huán)發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單鏈 DNA 分子，環(huán)部與靶DNA序列互補，為約15~35 bp，莖部由GC含量較高的與靶DNA無序列同源性的互補序列構(gòu)成，約8 bp，探針的5'端與3'端分別標(biāo)記熒光報告基團和熒光淬滅基團。當(dāng)分子信標(biāo)處于自由狀態(tài)時，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的兩個末端靠近使熒光報告基團與淬滅熒光基團靠近，熒光信號被淬滅。當(dāng)有靶序列存在時，分子信標(biāo)與靶序列結(jié)合，使分子信標(biāo)的莖稈區(qū)被拉開，3'端與5'端分離，此時熒光報告基團不能被淬滅，熒光檢測儀器可檢測到熒光。隨著每次擴增產(chǎn)物的積累，熒光強度增加，可反映出每次擴增末擴增產(chǎn)物積累的量。分子信標(biāo)法的特點是探針可循環(huán)利用，理論上分子信標(biāo)能區(qū)分僅單個核苷酸差異的DNA，特異性比常規(guī)等長的寡核苷酸探針更明顯。但探針標(biāo)記較復(fù)雜，并且要求游離在溶液中時探針能無選擇性折疊，否則會造成部分熒光本底信號;同樣當(dāng)莖結(jié)構(gòu)的熱力學(xué)溫度過高時，則會影響探針與靶序列雜交。
突變擴增阻滯系統(tǒng)（amplification refractory mutation system，ARMS）。于1989年初次建立，是對多重PCR技術(shù)應(yīng)用的借鑒和發(fā)展。也稱等位基因特異性擴增法（Allele-specific amplification）ASA，或等位基因特性PCR（allele-specific PCR,ASPCR）等，為在同一系統(tǒng)中同時檢測兩種或多種等位基因突變位點奠定了基礎(chǔ)。主要的ARMS法如：Scorpion（蝎型）引物/探針法，是由1條發(fā)夾結(jié)構(gòu)的探針和1條引物構(gòu)成，探針的5'端和3'端分別標(biāo)有報告熒光和淬滅熒光，3'端通過1個非擴增的單體(防止探針退火后的延伸) 與引物的5'端相連。在探針上由于熒光報告基團與淬滅基團相互靠近，不發(fā)熒光。變性階段，探針的發(fā)夾結(jié)構(gòu)會解開，在退火時則與模板相結(jié)合，形成線性分子，報告基團同淬滅基團分離而發(fā)射熒光。因此可檢測到報告熒光發(fā)出的熒光信號；ADxARMS法，由1條單環(huán)引物和一條雙環(huán)形探針構(gòu)成，根據(jù)突變序列設(shè)計特異性的ARMS引物，該ARMS引物在第一階段擴增中采用較高的退火溫度，ARMS引物擴增的特異性較好，只能夠擴增與之匹配的突變序列，但擴增效率較低。本階段擴增的目的是將模板中較少的突變序列進行放大。起到突變富集的作用。同時該ARMS 引物的5’端帶上為第二階段擴增準(zhǔn)備的特殊序列。第二階段中采用較低的退火溫度，同時采用通用引物進行擴增，通用引物是針對第一階段擴增過程中引物5’端的特殊序列。這樣較低的退火溫度，保證了擴增的高效率。擴增得到的模板用新型探針進行檢測。此方法大大提高了檢測的靈敏度，可準(zhǔn)確檢測出含量低至1%的突變DNA。
3.數(shù)字PCR技術(shù)
數(shù)字PCR(digitalPCR,dPCR)是近年來引起重視并迅速發(fā)展起來的一種突破性的定量分析技術(shù)。1992年Sykes等檢測復(fù)雜背景下低豐度的IgH重鏈突變基因時，利用樣品的有限稀釋，讓每個孔中只獲得單個模板分子，通過計算PCR擴增后的信號，以期準(zhǔn)確地確定起始分子的數(shù)量，雖然沒有明確提出“數(shù)字PCR”的概念，但是已經(jīng)建立了數(shù)字PCR基本的實驗流程，并且確定了數(shù)字PCR檢測中一個極其重要的原則——以“終點信號的有或無”作為定量方法。這是數(shù)字PCR的雛形。1999年Vogelstein等在檢測糞便中進行癌變組織脫離細(xì)胞的BRAF突變時，因受到體細(xì)胞基因的干擾，而碰到檢測靈敏度和檢測分辨率的瓶頸，而采用了在384孔板中對每個反應(yīng)孔的樣品量進行極限稀釋并增加反應(yīng)孔數(shù)進行檢測的方式, 從而提出了數(shù)字式PCR的概念，同時也提出如果采用更多孔板其檢測靈敏度會更高，從而指出了數(shù)字PCR系統(tǒng)的發(fā)展方向。
圖3：數(shù)字PCR原理示意圖
數(shù)字PCR一般包括兩部分內(nèi)容,即PCR擴增和熒光信號分析。在PCR擴增階段，數(shù)字PCR先將樣品稀釋到單分子水平，再平均分配到幾十至幾萬個單元中進行反應(yīng)。與qPCR對每個循環(huán)進行實時熒光測定的方法不同,數(shù)字PCR是在擴增結(jié)束后對每個反應(yīng)單元的熒光信號進行采集，有熒光信號記為1，無熒光信號記為0，有熒光信號的反應(yīng)單元中至少包含一個拷貝的。理論上，在樣品中目標(biāo)DNA濃度極低的情況下，有熒光信號的反應(yīng)單元數(shù)目等于目標(biāo)DNA分 子的拷貝數(shù)。但是，通常每反應(yīng)單元中可能包含兩個或兩個以上的目標(biāo)分子，就需要使用泊松概率分布函數(shù)(Poisson distribution)進行計算，根據(jù)反應(yīng)單元總數(shù)、有熒光信號的單元數(shù)以及樣品的稀釋系數(shù)，就可以得到樣本的最初拷貝數(shù)(濃度)。
數(shù)字PCR的關(guān)鍵是稀釋模板,通過將一個樣本分成幾十到幾萬份，分配到不同的反應(yīng)單元，每個單元包含0個或一個(至多數(shù)個拷貝) 的目標(biāo)分子，在每個反應(yīng)單元中分別對目標(biāo)分子進行PCR擴增，擴增結(jié)束后對每個反應(yīng)單元的熒光信號進行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)字PCR的靈敏度,除了與檢測器的靈敏度和PCR擴增效率等因素有關(guān)外，很大程度上取決于反應(yīng)單元的數(shù)目。反應(yīng)單元的數(shù)目越多，數(shù)字PCR的靈敏度越高，準(zhǔn)確度也越高。根據(jù)反應(yīng)單元形成的不同方式, 主要有微反應(yīng)室/ 孔板、微流控芯片和微滴等三類數(shù)字 PCR系統(tǒng)。（1）微反應(yīng)室/孔板數(shù)字PCR：早期的數(shù)字PCR技術(shù)采用96/384孔板作為反應(yīng)單元。但是數(shù)字PCR技術(shù)的靈敏度取決于反應(yīng)單元的總數(shù)，反應(yīng)單元數(shù)越多越有利于提高靈敏度和準(zhǔn)確度，普通的96/384孔板無法滿足檢測的需要。因此，出現(xiàn)了成倍提高反應(yīng)單元數(shù)目的做法，反應(yīng)體積從微升級降至納升級。但是隨著反應(yīng)單元數(shù)目的增多、反應(yīng)體積的減少，人工操作無法實現(xiàn)快速精準(zhǔn)取樣，就需要借助高通量自動上樣設(shè)備, 大幅提高了儀器成本和操作復(fù)雜性；（2）微流控芯片數(shù)字PCR：微流控芯片技術(shù)的使用使數(shù)字PCR能夠快速并準(zhǔn)確地將樣品流體分成若干個獨立的單元，進行多步平行反應(yīng)，成本低、體積小和高通量，是理想的數(shù)字PCR平臺。目前Fluidigm公司的Bio-MarkTM基因分析系統(tǒng)，Life Technologies公司的QuantStudioTM 3D數(shù)字PCR系統(tǒng)均均為采用微流控芯片技術(shù)的數(shù)字PCR系統(tǒng)；（3）微滴數(shù)字PCR：源于乳液PCR(emulsion PCR)技術(shù)，利用微滴發(fā)生器可以一次生成數(shù)萬乃至數(shù)百萬個納升甚至皮升級別的單個油包水微滴，作為數(shù)字PCR的樣品分散載體。PCR反應(yīng)結(jié)束后檢測每個微滴的熒光信號。通過油水兩相間隔得到的以液滴為單位的PCR反應(yīng)體系，更容易實現(xiàn)小體積和高通量，而且系統(tǒng)簡單，成本低，因此成為理想的數(shù)字PCR技術(shù)平臺。目前Rain Dance公司的Rain DropTM數(shù)字PCR 系統(tǒng)，Bio-Rad公司的QX100系統(tǒng)、QX200系統(tǒng)均為采用液滴技術(shù)的數(shù)字PCR系統(tǒng)。
雖然數(shù)字PCR概念提出至今已經(jīng)有二十多年,但其應(yīng)用仍處于起步階段，但是由于其獨特的技術(shù)優(yōu)勢和應(yīng)用前景，近幾年來其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展相當(dāng)迅速，應(yīng)用也越來越得到重視，已經(jīng)成功的應(yīng)用于腫瘤組織內(nèi)的 EGFR檢測以及EGFR突變頻率的分析。
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