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第三節(jié) 全自動免疫組化染色系統(tǒng)

一、導(dǎo)言

抗原修復(fù)技術(shù)發(fā)明以后，現(xiàn)代免疫組化技術(shù)才得到了空前的發(fā)展。隨著病理標(biāo)本大量增加，免疫組化染色量也呈爆發(fā)式增長，臨床對免疫組化自動化的需求也日益加劇。但免疫組化自動化的發(fā)展比較緩慢，究其原因并非自動化技術(shù)不夠成熟，而是由于免疫組化是“鏈?zhǔn)健狈磻?yīng)，影響免疫組化染色結(jié)果的因素很多，這些影響因素通常環(huán)環(huán)相扣，而要通過自動化實(shí)現(xiàn)免疫組化染色，所需控制的關(guān)鍵細(xì)節(jié)就更多。

對穩(wěn)定可靠免疫組化染色結(jié)果的要求和越來越多生物標(biāo)志物的應(yīng)用促使免疫組化自動化成為病理技術(shù)發(fā)展的必然趨勢�；�于不同原理的各類免疫組化自動化系統(tǒng)發(fā)展迅速，免疫組化自動化系統(tǒng)的出現(xiàn)是病理組織學(xué)技術(shù)領(lǐng)域的重要進(jìn)展和創(chuàng)新。免疫組化實(shí)現(xiàn)自動化后染色過程可由電腦自動化控制，使技術(shù)員從大量實(shí)驗(yàn)中解放出來，減少了人為操作誤差的可能性，從而提高了染色的一致性、可重現(xiàn)性和可靠性，推動了免疫組化技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)程。

二、技術(shù)發(fā)展歷程與特點(diǎn)

1. 技術(shù)發(fā)展歷程

免疫組化自動化技術(shù)需要克服的困難很多，其技術(shù)發(fā)展歷程相當(dāng)艱難而漫長。免疫組化自動化技術(shù)的發(fā)展屬美國最為領(lǐng)先，歐洲其次，其技術(shù)發(fā)展過程大概可分為以下三個(gè)階段：

第一階段：原始設(shè)計(jì) (1988-1994年)；

第二階段：實(shí)際應(yīng)用 (1995-2004年)；

第三階段：改進(jìn)創(chuàng)新 (2005-2016年)；

各發(fā)展階段的代表產(chǎn)品及性能特點(diǎn)見圖1。

2.工作原理

免疫組化染色的操作步驟主要有：脫蠟、水化、抗原修復(fù)、一抗、檢測系統(tǒng)、顯色（DAB或其它染料）、復(fù)染、干燥、透明、封片等。免疫組化自動化的原理是利用計(jì)算機(jī)控制軟件模擬手工免疫組化操作步驟，通過條形碼、二維碼或數(shù)字芯片自動數(shù)字化識別切片及相關(guān)試劑，利用加熱元件控制切片孵育/修復(fù)溫度，使用加樣排液系統(tǒng)自動加樣和排液，從而將免疫組化染色的部分或全部步驟轉(zhuǎn)移到儀器上，從而實(shí)現(xiàn)自動化染色。免疫組化自動化染色系統(tǒng)的工作原理主要分為四大類：

（1）毛細(xì)管虹吸原理

毛細(xì)管虹吸原理由Dr. David Brigati發(fā)明，利用該原理將兩張組織切片或一張組織切片和另一張蓋片緊密靠近，使其形成能產(chǎn)生虹吸現(xiàn)象的間隙。免疫組化染色過程中使用的試劑可通過這種虹吸現(xiàn)象實(shí)現(xiàn)組織覆蓋。

（2）液蓋膜原理

在每一步滴加試劑前先用油狀液體鋪滿待測組織，然后將試劑滴在油狀液體中央，利用試劑比油狀液體的比重大而沉到底部的原理，使試劑覆蓋組織。同時(shí)，油狀液體可形成一層保護(hù)膜，防止試劑蒸發(fā)。

（3）通用系統(tǒng)

通用系統(tǒng)的設(shè)計(jì)原理及操作步驟與手工操作原理及步驟最為相似，是高度模擬手工操作的一種設(shè)計(jì)。通用系統(tǒng)又可分為半自動化和全自動化兩種方式，半自動化通用系統(tǒng)的脫蠟和抗原修復(fù)步驟并非儀器自動完成，而是要通過人工處理或干預(yù)，操作步驟和手工操作基本一致。而全自動通用系統(tǒng)的脫蠟和抗原修復(fù)步驟由儀器自動完成。

（4）固蓋膜原理

在玻片上方設(shè)計(jì)一種可運(yùn)動的固蓋板，固蓋板在試劑孵育過程中會根據(jù)設(shè)計(jì)要求運(yùn)動，帶動玻片表面試劑運(yùn)動，促進(jìn)試劑混合均勻，同時(shí)也起到減少試劑蒸發(fā)和流失的作用。

3. 制造商代表性產(chǎn)品簡介

市場上應(yīng)用較為廣泛的代表性產(chǎn)品見表1。

三、國內(nèi)外行業(yè)現(xiàn)狀及分析

在國際上，免疫組化自動化行業(yè)的發(fā)展與其技術(shù)的發(fā)展息息相關(guān)，大致可分成2個(gè)階段。

1.       第一階段，自由發(fā)展階段（1988-2007年）

在這個(gè)階段，以Dako為代表的免疫組化試劑生產(chǎn)商為了促進(jìn)其試劑的銷售與推廣，不惜重金紛紛投入到免疫組化自動化領(lǐng)域。原理各異的免疫組化自動化儀器爭相上市。因研發(fā)是由免疫組化試劑市場商所主導(dǎo)，所以該階段半自動通用系統(tǒng)占據(jù)主導(dǎo)地位。

2. 第二階段，并購整合階段（2008-2016年）

隨著免疫組化技術(shù)應(yīng)用的不斷發(fā)展以及各種靶向藥物的上市，免疫組化自動化市場成為資本市場關(guān)注的目標(biāo)。大型制藥廠商為了更好地推廣其靶向藥物，不惜代價(jià)收購免疫組化自動化制造商。其中最典型的案例是，2008年1月瑞士制藥商Roche公司花費(fèi)34億美元收購免疫組化自動化制造商Ventana。通過隨后幾年的一系列并購，行業(yè)內(nèi)的中小企業(yè)逐漸走向衰亡，技術(shù)和資源逐漸集中于大型企業(yè)，行業(yè)內(nèi)競爭對手越來越少，行業(yè)門檻越來越高。同時(shí)，市場上半自動通用系統(tǒng)的主流地位也逐步被試劑封閉式的全自動染色儀所替代。

目前，免疫組化自動化行業(yè)幾乎被極少數(shù)外資企業(yè)壟斷，這些外資企業(yè)大多采用“儀器免費(fèi)、試劑封閉”的商業(yè)模式：廠商以極低的價(jià)格將免疫組化全自動化儀器銷售或租賃給客戶，通過技術(shù)手段將儀器上使用的試劑進(jìn)行限制，最終通過銷售的儀器配套專用試劑來獲取相對較高利潤。

國內(nèi)免疫組化自動化行業(yè)現(xiàn)狀也非常類似，外資壟斷了絕大多數(shù)的市場份額。國產(chǎn)免疫組化儀器寥寥可數(shù)，其產(chǎn)品仍然停留在仿制技術(shù)含量較低國際知名的半自動通用系統(tǒng)上。出現(xiàn)以上行業(yè)現(xiàn)狀的原因有很多，主要包括：①核心技術(shù)仍掌握在極少數(shù)幾家大型外資企業(yè)手中；②影響染色質(zhì)量的因素很多，如脫蠟效果、抗原修復(fù)效果、試劑覆蓋組織效果、試劑滴加精準(zhǔn)度、溫控系統(tǒng)、清洗效果等，外資企業(yè)對這些細(xì)節(jié)的處理技術(shù)更加成熟；③研發(fā)周期長，一般需5年以上，需要長期穩(wěn)定的核心研發(fā)團(tuán)隊(duì)；④研發(fā)資金巨大，通常須數(shù)千萬美元，而國內(nèi)免疫組化企業(yè)往往資金實(shí)力有限；⑤免疫組化自動化制造商通常已有多年免疫組化試劑的研發(fā)，而國內(nèi)企業(yè)自身往往并未掌握免疫組化試劑的核心技術(shù)。

近年來，我國免疫組化自動化行業(yè)也取得較大突破，通過設(shè)立海外研發(fā)中心、技術(shù)引進(jìn)等方式加大該領(lǐng)域的研發(fā)力度，國產(chǎn)免疫組化自動化產(chǎn)品相繼出現(xiàn)，逐步打破了外企壟斷。但我國免疫組化自動化行業(yè)的發(fā)展之路還很漫長，國內(nèi)企業(yè)任重道遠(yuǎn)。

四、 結(jié)語

21世紀(jì)以來，免疫組化自動化得到空前發(fā)展，不僅大大提高了工作效率，也提高了免疫組化染色結(jié)果的一致性、可重現(xiàn)性和可靠性，極大地推進(jìn)了質(zhì)控工作的開展，為免疫組化標(biāo)準(zhǔn)化奠定了基礎(chǔ)。但現(xiàn)有的免疫組化自動化染色系統(tǒng)仍存在較多不足，目前免疫組化自動化染色系統(tǒng)只是極大程度地模擬手工免疫組化染色過程，其靈活性始終無法超過操作熟練的技術(shù)員，且受多種試劑及抗原修復(fù)條件限制，因此短期內(nèi)自動化染色結(jié)果很難超過優(yōu)秀的手工染色結(jié)果。大家應(yīng)當(dāng)清醒的認(rèn)識到：無論選用哪種型號的免疫組化自動化染色系統(tǒng)，人始終是決定染色結(jié)果好壞的關(guān)鍵因素。預(yù)計(jì)免疫組化自動化未來的發(fā)展趨勢仍將是大通量、流水線工作以及優(yōu)良穩(wěn)定的個(gè)性化免疫組化染色方案。

第四節(jié) 免疫組化國家相關(guān)政策法規(guī)

一、注冊分類管理的逐漸完善

我國體外診斷試劑產(chǎn)業(yè)經(jīng)過30多年的不斷探索和發(fā)展，技術(shù)日趨成熟，監(jiān)管日趨完善。早期，體外生物診斷試劑按照藥品進(jìn)行管理，但監(jiān)管并不嚴(yán)格。在2007年4月19日，國家食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的《體外診斷試劑注冊管理辦法（辦法）》（國食藥監(jiān)械[2007]229號）中，將體外診斷試劑歸為醫(yī)療器械進(jìn)行管理（血源篩查、采用放射性核素標(biāo)記的體外診斷試劑除外）。

依據(jù)該辦法，體外診斷試劑按照產(chǎn)品風(fēng)險(xiǎn)從低到高分為第一類、第二類、第三類體外診斷試劑。境內(nèi)第一、二、三類體外診斷試劑分別由所在市級、省級（或自治區(qū)、直轄市）食品藥品監(jiān)督管理部門以及國家食品藥品監(jiān)督管理局進(jìn)行審查注冊，而境外體外診斷試劑則均由國家食品藥品監(jiān)督管理局負(fù)責(zé)審查注冊。

2013年11月26日，國家食品藥品監(jiān)督管理總局印發(fā)了《關(guān)于印發(fā)體外診斷試劑分類子目錄的通知》（食藥監(jiān)械管[2013]242號）及《6840體外診斷試劑分類子目錄（2013版）》，詳細(xì)闡明了體外診斷試劑的產(chǎn)品類別、產(chǎn)品分類名稱、預(yù)期用途、管理類別，為體外診斷試劑的注冊申報(bào)工作提供了指導(dǎo)。

根據(jù)《體外診斷試劑注冊管理辦法（辦法）》，免疫組化抗體試劑因與致病性病原體抗原、抗體以及核酸等檢測相關(guān)，也與腫瘤標(biāo)志物檢測相關(guān)，屬于第三類體外診斷試劑；免疫組化配套試劑，如DAB染色液、抗原修復(fù)液等，屬于第一類體外診斷試劑（見附表1）。

2013年，國家食品藥品監(jiān)督管理總局醫(yī)療器械技術(shù)審評中心出臺了第一部與免疫組化試劑相關(guān)的規(guī)范性文件——《免疫組織化學(xué)抗體試劑及檢測試劑盒注冊申報(bào)資料的基本要求》，該要求結(jié)合臨床及病理檢測中的應(yīng)用實(shí)踐、臨床病理專家和生產(chǎn)企業(yè)的建議，規(guī)范了免疫組化抗體試劑的命名方式，并對說明書書寫格式、產(chǎn)品研究及臨床等，同時(shí)依據(jù)不同標(biāo)志物的臨床應(yīng)用情況，將免疫組化試劑分為A類和B類，并提出注冊臨床樣本數(shù)量要求（表1）。

為了更好地推進(jìn)體外診斷試劑行業(yè)健康、有序發(fā)展，2014年國家大刀闊斧，對醫(yī)療器械行業(yè)進(jìn)行了一次重大變革。2014年3月7日，國家食品藥品監(jiān)督管理總局發(fā)布了新版醫(yī)療器械的總綱性法規(guī)——《醫(yī)療器械監(jiān)督管理?xiàng)l例》（國務(wù)院令第650號）。此后，圍繞此項(xiàng)條例陸續(xù)發(fā)布了60多項(xiàng)配套法律、法規(guī)文件，對醫(yī)療器械行業(yè)的管理作了很大調(diào)整，包括法規(guī)、機(jī)構(gòu)分工、結(jié)構(gòu)人員等，如第一類體外診斷試劑則由原先的注冊管理改為備案管理，第二類、第三類體外診斷試劑依然實(shí)行注冊管理；注冊質(zhì)量管理體系核查也由以往的注冊申報(bào)前進(jìn)行，調(diào)整為注冊申報(bào)后開展。新的法規(guī)條例更強(qiáng)調(diào)企業(yè)產(chǎn)品研制、生產(chǎn)、臨床、注冊申報(bào)過程的真實(shí)性，并加強(qiáng)對此過程的監(jiān)督管理。為此，企業(yè)必須建立健全的質(zhì)量管理體系，并確保有效運(yùn)行。

二、生產(chǎn)監(jiān)管的逐漸嚴(yán)格

2007年4月28日，國家食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布了《體外診斷試劑生產(chǎn)實(shí)施細(xì)則（試行）》，首次對歸屬醫(yī)療器械管理的體外診斷試劑的生產(chǎn)及質(zhì)量管理體系作了詳細(xì)的規(guī)定和指導(dǎo)，并明確要求大部分體外診斷試劑必須具備100,000級凈化環(huán)境的生產(chǎn)工藝環(huán)境，但此項(xiàng)法規(guī)對于研制、使用等方面的要求相對比較薄弱。

2014-2015年發(fā)布的《醫(yī)療器械生產(chǎn)監(jiān)督管理辦法》（局令第7號）和《醫(yī)療器械生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范附錄體外診斷試劑》（2015年第103號公告）等，對體外診斷試劑的研制、生產(chǎn)、經(jīng)營、使用4個(gè)環(huán)節(jié)提出嚴(yán)格規(guī)范要求，進(jìn)一步明確了使用單位對體外診斷試劑安全管理的義務(wù)，避免了執(zhí)法空白，并加強(qiáng)了監(jiān)督管理。在新法規(guī)的形勢下，藥監(jiān)管理部門加大了現(xiàn)場檢查頻率，日常檢查、注冊核查、生產(chǎn)許可核查、飛行檢查、整改復(fù)查等給企業(yè)生產(chǎn)管理帶來巨大壓力，但這同時(shí)也促進(jìn)了企業(yè)自身質(zhì)量管理體系的規(guī)范，保障了產(chǎn)品的生產(chǎn)質(zhì)量及使用安全。在嚴(yán)厲的監(jiān)管和高頻度的檢查中，眾多不規(guī)范企業(yè)面臨淘汰或被迫出局，而具有行業(yè)領(lǐng)先優(yōu)勢的企業(yè)將繼續(xù)推動體外診斷行業(yè)的健康發(fā)展。

三、行業(yè)發(fā)展的逐漸規(guī)范

2014年起，國家食品藥品監(jiān)督管理總局持續(xù)不斷地采取一系列監(jiān)管舉措，來規(guī)范醫(yī)療器械市場。從2014年集中5個(gè)月的“五整治”專項(xiàng)行動到2015年的“五整治回頭看”、體外診斷試劑質(zhì)量評估和綜合治理工作，足以看出國家總局對醫(yī)療器械行業(yè)越來越明確的態(tài)度，以及越來越嚴(yán)厲的管控措施，其中重點(diǎn)監(jiān)管和查處醫(yī)療器械虛假注冊申報(bào)、違規(guī)生產(chǎn)、非法經(jīng)營、夸大宣傳、使用無證產(chǎn)品等五種行為。后續(xù)又發(fā)布了《藥品醫(yī)療器械飛行檢查辦法》，對企業(yè)和使用單位進(jìn)行無告知的突擊性檢查，進(jìn)一步加強(qiáng)了企業(yè)和使用單位對自身生產(chǎn)或使用的規(guī)范管理。

國家食品藥品監(jiān)督管理總局對醫(yī)療器械行業(yè)監(jiān)管逐漸嚴(yán)格、規(guī)范，帶來的是機(jī)遇與挑戰(zhàn)并存，體外診斷試劑作為醫(yī)療器械分類中極為特殊的一類，在整治、飛檢的風(fēng)暴中逐步成長的同時(shí)，也受到了很大的沖擊。在一系列的整治活動中，部分類型體外診斷試劑由于品種多、臨床難、注冊慢，給監(jiān)管帶來極大的困難和分歧。就免疫組化而言，近年來病理學(xué)科發(fā)展迅速，新的免疫組化標(biāo)記物不斷出現(xiàn)，目前常規(guī)用于病理診斷的抗體試劑達(dá)到兩三百種，當(dāng)前的注冊產(chǎn)品遠(yuǎn)無法滿足臨床診斷的日常需求，無證產(chǎn)品的使用又與國家監(jiān)管相矛盾，用與不用處于兩難境地。為解決現(xiàn)狀，分類調(diào)整勢在必行。

放眼國外，免疫組化的分類也經(jīng)歷了漫長的改革演變。在美國，免疫組化產(chǎn)品分類經(jīng)歷了多年的討論，于1998年，美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)發(fā)布了《Guidance For Submission of Immunohistochemistry Applications to the FDA》。該指南作為FDA免疫組化的管理規(guī)范，將免疫組化抗體統(tǒng)分為三大類：絕大多數(shù)抗體作為Ⅰ類，主要提供輔助診斷信息；少部分作為Ⅱ類，主要提供預(yù)后及預(yù)測信息；極少數(shù)有臨床意義的創(chuàng)新標(biāo)記物作為Ⅲ類。

我國在結(jié)合發(fā)展現(xiàn)狀不斷改革創(chuàng)新的同時(shí)，也在借鑒發(fā)達(dá)國家同類產(chǎn)品的監(jiān)管模式，2016年 9月21號，器械注冊司發(fā)布了《關(guān)于征求過敏原等三類體外診斷試劑分類調(diào)整意見的函》，對免疫組化產(chǎn)品的分類進(jìn)行重新調(diào)整。免疫組化產(chǎn)品中，預(yù)期用途包含用藥指導(dǎo)、或明確用于腫瘤或遺傳病診斷的免疫組化試劑作為三類體外診斷試劑管理，其余的免疫組化產(chǎn)品大多被調(diào)整為二類，甚至有部分產(chǎn)品不作為醫(yī)療器械管理。這將會是國家食品藥品監(jiān)督管理總局在免疫組化產(chǎn)業(yè)注冊和監(jiān)管方面又一個(gè)重大改革。

綜上可以看出，我國體外診斷行業(yè)仍處在不斷發(fā)展的階段，近幾年來國家對體外診斷試劑的監(jiān)管逐步規(guī)范和加強(qiáng)，在多次專項(xiàng)整頓和調(diào)整中，體外診斷試劑市場正逐步朝著規(guī)范的方向發(fā)展。