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抗原（antigen，縮寫Ag）指能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生（特異性）免疫應(yīng)答，并能與免疫應(yīng)答產(chǎn)物抗體和致敏淋巴細(xì)胞在體外結(jié)合，發(fā)生免疫效應(yīng)（特異性反應(yīng)）的物質(zhì)�？乖�分子表面的有限部位能與抗體分子結(jié)合，稱此部位為抗原決定簇（antigen determinant）或表位（epitope）。因此抗原的抗原性主要決定于抗原分子的化學(xué)性質(zhì)。如抗原為蛋白質(zhì)分子，其抗原性可決定于其氨基酸序列或其空間構(gòu)型。

抗原分子的B細(xì)胞決定簇大小不同，其最大表面積約為50～70mm約由4～6氨基酸殘基或糖基組成。100個氨基酸殘基多肽可有14到20個非重疊決定簇，由線狀排列彼此相鄰的氨基酸組成，故稱為線性或連續(xù)性決定簇。而球蛋白是有三維空間的折疊肽鏈，故其大多數(shù)決定簇被掩蓋在內(nèi)部，可稱為隱蔽性決定簇。只存在于其表面的決定簇可被免疫細(xì)胞識別，或與抗體結(jié)合者稱為功能性決定簇（圖）。組成這種決定簇的氨基酸，是由折疊的肽鏈將有同位置的氨基酸使之相鄰成為有一定空間構(gòu)型的決定簇，故稱為構(gòu)像決定簇或不連續(xù)決定簇�，F(xiàn)已證明抗原分子的抗原性是由其組成的氨基酸予列、空間構(gòu)型及其決定簇片段的移動決定的。

許多天然物質(zhì)可誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，其中大分子蛋白質(zhì)和多糖具有強(qiáng)免疫原性，小分子多肽及核酸也具有免疫原性。

（一）化學(xué)組成

大分子蛋白質(zhì)，分子量大于10000者，可含有大量不同的抗原決定簇，是最強(qiáng)的免疫原。如異種血清蛋白、酶蛋白及細(xì)菌毒等，是強(qiáng)免疫原蛋白質(zhì)的例子。

多糖是重要的天然抗原，純化多糖或糖蛋白、脂蛋白以及糖脂蛋白等復(fù)合物中的糖分子部分都具有免疫原性。在自然界，許多微生物有富含多糖的莢膜或胞壁，細(xì)菌內(nèi)毒素是脂多糖，以及一些血型抗原（A、B、C、H）也是多糖。

核酸分子多無免疫原性，但如與蛋白質(zhì)結(jié)合形成為核蛋白則有免疫原性。在自身免疫病中，可見對天然核蛋白誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答產(chǎn)生的抗DNA或RNA抗體。

此外，多肽類激素如胰島素雖為小分子量（6000）亦具有免疫原性。來自一種動物的胰島素，如長期用于另一種動物，亦能誘導(dǎo)免疫應(yīng)答產(chǎn)生抗體。

（二）分子量

凡具有免疫原性的物質(zhì)，其分子量都較大，一般在1萬以上，小于1萬者呈弱免疫原性，低于4000者一般不具有免疫原性。許多小的免疫性原性分子可激發(fā)細(xì)胞免疫，而不產(chǎn)生抗體。亦有大分子量物質(zhì)，如明膠分子量可達(dá)10萬，但因其為直鏈氨基酸結(jié)構(gòu)，易在體內(nèi)降解為低分子物質(zhì)，所以呈弱免疫原性。可見免疫原性除與分子量有關(guān)外，還與其化學(xué)結(jié)構(gòu)相關(guān)。

（三）化學(xué)結(jié)構(gòu)

在蛋白質(zhì)分子中，凡含有大量芳香族氨基酸，尤其是含有酷氨酸的蛋白質(zhì)，其免疫原性強(qiáng)；而以非芳香族氨基酸為主的蛋白質(zhì)，其免疫原性較弱。蛋白質(zhì)和多糖抗原，凡結(jié)構(gòu)復(fù)雜者免疫原性強(qiáng)，反之則較弱。其復(fù)雜性是由氨基酸和單糖的類型及數(shù)量等決定的。如聚合體蛋白質(zhì)分子較單體可溶性蛋白質(zhì)分子的免疫原性強(qiáng)。

自發(fā)現(xiàn)抗體后，用血清學(xué)方法在體外實(shí)驗，證明了天然抗原與其相應(yīng)抗體發(fā)生特異性結(jié)合，這是一個重要的免疫學(xué)現(xiàn)象，稱這種特性為抗原的抗原性。在早期由于尚未建立對蛋白質(zhì)抗原進(jìn)行分析的方法，為研究抗原性的化學(xué)本質(zhì)造成了困難。奧地利免疫化學(xué)家Landsteiner在本世紀(jì)20年代創(chuàng)建了人工結(jié)合抗原，并應(yīng)用血清學(xué)方法對抗原性的化學(xué)本質(zhì)進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，為抗原、抗體的相互作用提供了大量知識，為天然抗原化學(xué)性質(zhì)的研究奠定了基礎(chǔ)。

抗原在診斷工業(yè)的用途，一方面是與前文抗體的用途相對，用來檢測抗體如自身抗體、傳染性疾病抗體等，另一方面廣泛地應(yīng)用于試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和校準(zhǔn)品的制備，對血液樣本中的待測抗原進(jìn)行定量。

抗原產(chǎn)品主要分為天然抗原、重組抗原、合成抗原等。天然抗原可取自動物組織、微生物培養(yǎng)物等，需經(jīng)提取純化才能使用；重組抗原是抗原基因在質(zhì)粒體中表達(dá)的蛋白質(zhì)抗原，多以大腸桿菌或酵母菌為質(zhì)粒體。重組抗原的優(yōu)點(diǎn)是除工程菌成分外，其他雜質(zhì)少，而且無傳染性，但純化技術(shù)難度較大。重組抗原的另一特點(diǎn)是能用基因工程制備某些無法從天然材料中分離的抗原物質(zhì)。合成多肽抗原是根據(jù)蛋白質(zhì)抗原分子的某一抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。多肽抗原一般只含有一個抗原決定簇，純度高，特異性也高，但由于分子質(zhì)量太小，往往難以直接吸附于固相上。多肽抗原的包被一般需先使其與無關(guān)蛋白質(zhì)如牛血清白蛋白等偶聯(lián)，借助于偶聯(lián)物與固相載體的吸附，間接的結(jié)合到固相載體表面。

 抗原性能的核心是對其在待測樣本中存在形式的真實(shí)模擬。在工業(yè)生產(chǎn)中，抗原作為免疫原也決定了由其產(chǎn)生的抗體的關(guān)鍵性能，如特異性和靈敏度。不同抗原的比較如下圖。

抗原作為主要的核心原材料，對于整個免疫檢測分析系統(tǒng)有著至關(guān)重要的影響。除去試劑制備工藝外，抗原自身的性能可在很大程度上決定著檢測試劑的質(zhì)量。目前，衡量抗原質(zhì)量的技術(shù)指標(biāo)沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，但是可以大概總結(jié)為生物活性、純度、批間差、穩(wěn)定性等。

抗原的生物活性首先要求該產(chǎn)品與臨床樣本中的天然抗原具有高度一致的免疫化學(xué)特性，除了具備相同的氨基酸殘基數(shù)、相同的分子量，還需要有相同的空間構(gòu)象和修飾。為獲得優(yōu)質(zhì)的抗原，原料生產(chǎn)廠家往往需要先對樣本中天然抗原的存在形式進(jìn)行深入研究，如微生物致病株的特異性抗原表位、人體內(nèi)天然蛋白在臨床樣本中的存在形式、在檢測體系中存在的干擾因素等等，從而設(shè)計該抗原的研發(fā)和生產(chǎn)路徑——進(jìn)行天然提取或重組、合成；采用原核細(xì)胞或真核細(xì)胞表達(dá)；以游離形式或多聚體形式甚或帶有載體；甚至產(chǎn)品以凍干粉、凍液或液體形式交付，都可能影響抗原的生物活性，需經(jīng)過原料廠商嚴(yán)謹(jǐn)細(xì)致的反復(fù)驗證。

關(guān)于純度，與抗體一樣，當(dāng)抗原作為原料用于檢測抗體時，往往需要先將抗原進(jìn)行修飾，當(dāng)抗原純度不夠時，會導(dǎo)致其他雜蛋白被一起偶聯(lián)于固相介質(zhì)或者標(biāo)記物上，從而影響了試劑的反應(yīng)性能，如特異性、反應(yīng)信號、背景值等。抗原的純度測定主要有SDS-PAGE電泳后的條帶掃描和HPLC測試等。

重復(fù)性/批間差，是指每批次產(chǎn)品的可重復(fù)性。重復(fù)性則是保證體外診斷試劑降低批間差異并且穩(wěn)定生產(chǎn)的前提條件。另外，如前所述，重復(fù)性和生產(chǎn)工藝密切掛鉤，因此也是體現(xiàn)抗原質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)。

穩(wěn)定性是指在特定的儲存條件下，一定時間內(nèi)抗原保持其活性的能力。抗原不像抗體那么穩(wěn)定，為保持抗原的穩(wěn)定性，多數(shù)供應(yīng)商提供的抗原的儲存條件為-20℃或-70℃，或4度儲運(yùn)的凍干粉，并強(qiáng)調(diào)抗原稀釋分裝后應(yīng)冷凍保存。而抗原制備產(chǎn)品的穩(wěn)定性由含各種保護(hù)成分如BSA、尿素、或商用蛋白穩(wěn)定劑保駕護(hù)航，該類Buffer往往也成為診斷試劑公司秘而不宣的核心競爭力之一。

采購抗原制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時，一般重點(diǎn)包含以下幾個方面：

性狀：澄清均一的液體或溶解/復(fù)溶后為澄清均一的液體，不應(yīng)含有異物、渾濁或搖不散的沉淀或顆粒。（部分抗原天然存在微白或渾濁現(xiàn)象，廠家一般有說明）

純度與分子量：純度標(biāo)準(zhǔn)按需設(shè)定，純度越高價格越高；采用SDS-PAGE凝膠電泳確定純度與分子量。

生物安全性：人源抗原務(wù)必要求原料供應(yīng)商確保HBsAg、HCV、HIV、TP呈陰性。

效價和功能性實(shí)驗：建議試劑廠商與原料供應(yīng)商協(xié)商確定基準(zhǔn)批次，對新批次的功能性實(shí)驗以與基準(zhǔn)批次的平行對照結(jié)果為依據(jù)進(jìn)行驗收。

1. 酶

2.1生化酶

   酶是體外診斷工業(yè)的重要原料，是臨床化學(xué)和分子診斷的核心原料，也是免疫診斷中酶-底物信號體系中不可或缺的成分。本小節(jié)主要介紹作為臨床化學(xué)核心原料的生化酶和作為分子診斷核心原料的分子診斷酶、引物、探針及相關(guān)產(chǎn)品。

   酶是生物催化劑，是由組織細(xì)胞合成的、具有生物催化功能的蛋白質(zhì)（少數(shù)是核酸），對化學(xué)反應(yīng)有強(qiáng)的催化性，對底物有極高的選擇性（包括對底物的種類，底物的區(qū)域，位點(diǎn)和立體的選擇性），一種酶只能夠催化一種底物的一種反應(yīng)，反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)率很高，幾乎沒有副反應(yīng)。酶的特性使得其在臨床檢驗，化學(xué)分析和特定產(chǎn)品生產(chǎn)上優(yōu)勢遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其他化

學(xué)方法。人體內(nèi)只有酶存在才能進(jìn)行各項生化反應(yīng)，所以人體內(nèi)的新陳代謝和酶的催化息息相關(guān)。一般來說，健康人體內(nèi)酶活性和酶量相對恒定，當(dāng)人體某些器官和組織發(fā)生病變時，特定的酶被釋放入血、尿或體液中，與之相關(guān)的酶量或者活性會發(fā)生相應(yīng)的變化。例如，當(dāng)胰腺發(fā)生急性病變時，脂肪酶大量釋放入血，其血清表達(dá)水平和胰腺炎病情嚴(yán)重程度有一定的相關(guān)性，早期檢測血清脂肪酶可以較好地區(qū)分急性和非急性胰腺炎。因而使用相應(yīng)的工具酶檢驗試劑盒等診斷工具測定血、尿或體液內(nèi)酶量或者活性變化，可以診斷某些疾病。

    人類使用酶的歷史源遠(yuǎn)流長。相傳夏禹時期，我國人民就發(fā)明了釀酒，后來又開始用豆發(fā)酵做成醬油等，在公元前6世紀(jì)，我國已經(jīng)開始用曲治療腸胃病，這估計是人類最早將酶應(yīng)用于疾病治療。19世紀(jì)初，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)胃液可以消化肉塊，植物提取物或者唾液可以將淀粉轉(zhuǎn)化成糖，但是他們并不清楚具體是什么物質(zhì)在起作用。法國化學(xué)家Louis Pasteur 在研究淀粉轉(zhuǎn)化成糖，又經(jīng)過酵母作用發(fā)酵成酒精的過程中，他提出這種發(fā)酵是由酵母中的一種活性物質(zhì)催化的，他將這種物質(zhì)稱之為酵素（ferment）。現(xiàn)在日語中酶就是“酵素”二字，一些歐洲國家仍然沿用了酵素一詞，立陶宛有一個做酶的公司名字就是Fermentas，后來被Thermofisher收購。1878年，德國生理學(xué)家Wilhelm Kühne第一次將這種物質(zhì)稱之為Enzyme，源于希臘語：ενζυμον，意為發(fā)酵中，用來描述這個催化過程。1926年，美國科學(xué)家J.B.Sumner從刀豆中提取出脲酶，并證實(shí)脲酶其實(shí)是一種蛋白質(zhì)。20世紀(jì)30年代，科學(xué)家們相繼提取出多種酶的蛋白質(zhì)結(jié)晶，并指出酶是一類具有生物催化作用的蛋白質(zhì)。后來科學(xué)家們又發(fā)現(xiàn)有一些RNA具有酶催化活性，稱之為核酶。所以確切的說，絕大多數(shù)酶是蛋白質(zhì)，有些酶是核酸和蛋白酶的復(fù)合體，少數(shù)酶是核酸。

1961年國際酶學(xué)會（IEC）根據(jù)酶催化反應(yīng)的類型將酶分為六大類，制定了系統(tǒng)命名法，規(guī)定每一種酶只有一個系統(tǒng)名稱和系統(tǒng)標(biāo)號，系統(tǒng)標(biāo)號由四個數(shù)字組成，如脂肪酶的系統(tǒng)標(biāo)號為 EC 3.1.1.3。六大類酶主要是催化反應(yīng)性質(zhì)不同，催化氧化還原反應(yīng)的酶稱為氧化還原酶類，包括氧化酶和還原酶；催化底物之間進(jìn)行某些基團(tuán)的轉(zhuǎn)移或交換的酶類稱為轉(zhuǎn)移酶類，如轉(zhuǎn)氨酶，葡萄糖轉(zhuǎn)移酶等；催化底物發(fā)生水解反應(yīng)的酶類稱為水解酶類，如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、磷酸酶等；催化從底物移去一個基團(tuán)并留下雙鍵的反應(yīng)或其逆反應(yīng)的酶類稱為裂解酶類，如脫水酶、脫羧酶，醛縮酶等；催化各種同分異構(gòu)體、幾何異構(gòu)體或光學(xué)異構(gòu)體之間相互轉(zhuǎn)化的酶類稱為異構(gòu)酶類，如異構(gòu)酶、消旋酶等；還有合成酶類，如DNA連接酶，tRNA連接酶等。

1961年國際酶學(xué)會規(guī)定了酶的活力單位：1個酶活力單位是指在特定條件（25℃，其它為最適條件）下，在1min內(nèi)能轉(zhuǎn)化1μmol底物的酶量，或是轉(zhuǎn)化底物中1μmol的有關(guān)基團(tuán)的酶量。因此，酶的活性就是酶的催化能力的大小。測定酶活性的方法有很多，不同的酶生產(chǎn)廠家也使用不同的方法測定酶的活性。國際臨床化學(xué)聯(lián)合會（IFCC）和各國家級協(xié)會推薦的酶活性測定的標(biāo)準(zhǔn)化參考方法是連續(xù)監(jiān)測法，即用適當(dāng)?shù)膬x器連續(xù)檢測整個酶促反應(yīng)中的底物消耗或者產(chǎn)物的生成量，一般是每十五秒到一分鐘檢測一次，隨著時間變化可以求出酶促反應(yīng)速度。

酶的活性中心（active center）是酶蛋白構(gòu)象的一個特定區(qū)域，只是酶分子中的很小部分，能與底物相結(jié)合并催化底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物。酶蛋白分子上只有少數(shù)氨基酸殘基與催化作用有關(guān)，大部分氨基酸殘基并不與底物接觸。酶的活性中心具有特定的三維空間結(jié)構(gòu)，或為裂縫/凹陷，多為氨基酸的疏水基團(tuán)組成的疏水環(huán)境。

酶作為具有特殊性能的生物催化劑，受到學(xué)術(shù)界與工業(yè)界高度重視。據(jù)統(tǒng)計，酶制劑全球產(chǎn)值約為100億美元，市場潛力大概在千億美元，酶的品種和應(yīng)用正處在快速增長階段，年復(fù)合增長率超過10%。人們于20世紀(jì)初開始將酶應(yīng)用于臨床診斷，到現(xiàn)在已經(jīng)有一百多年歷史。1900年，人們發(fā)現(xiàn)血清脂肪酶活性的升高對于急性胰腺炎有特異的診斷價值，1904年 Wohlge-muth 記述了急性胰腺炎病人的血清與尿中淀粉酶活性升高。1959年Karmen，La Due Wroblewski等人先后證實(shí)轉(zhuǎn)氨酶對肝炎和心肌梗死有診斷價值。后來學(xué)者們針對人體特定組織器官如心臟、肝臟、肌肉、腎臟、血液等發(fā)生病變與重要代謝酶的關(guān)系做了研究，并且確定了這些特定組織器官發(fā)生病變時與病人血中酶活性變化的關(guān)系。

我國人民使用酶的歷史雖然悠久，但是因為工業(yè)發(fā)展相對發(fā)達(dá)國家滯后，酶工業(yè)化快速發(fā)展是近幾十年的事。雖然我國人民將酶用于疾病治療有上千年的歷史，但是診斷酶學(xué)的研究卻開始于20世紀(jì)30年代，發(fā)展到80年代后，工具酶檢驗試劑盒開始生產(chǎn)和普及，并且引進(jìn)自動和半自動生化檢測儀，在血液生化成分如血糖、血脂等酶法測定，還有其他體液酶和同工酶方面的檢測都得到了大幅度的發(fā)展。

體外診斷試劑又被稱為“醫(yī)生的眼睛”，其質(zhì)量水平影響到臨床診斷的準(zhǔn)確性和速度，進(jìn)而一定程度上影響疾病的治療效果。而酶診斷方法可靠，便捷，所以在臨床診斷上得到廣泛應(yīng)用，一方面根據(jù)體內(nèi)與疾病有關(guān)的酶活性變化來診斷某些疾病，例如測定轉(zhuǎn)氨酶活性變化來診斷肝�。涣硪环矫胬�用酶來測定體內(nèi)與疾病有關(guān)的物質(zhì)的量來對疾病進(jìn)行診斷，例如利用葡萄糖氧化酶測定血糖含量來診斷糖尿病。

迄今為止，應(yīng)用于診斷的酶類達(dá)多100多種，在醫(yī)院檢驗科中應(yīng)用診斷酶量最大的是常規(guī)的生化檢驗，例如：肝功，腎功，心肌酶和血脂，這四項又統(tǒng)稱為大生化，其中有診斷價值的酶有12-15種。

隨著酶工程技術(shù)的發(fā)展，人們將葡萄糖氧化酶，葡萄糖脫氫酶，尿素酶和膽固醇酯酶等制備固定化酶，應(yīng)用于生物傳感器/POCT，用于測定血糖、尿酸、膽固醇的測定，檢測方法更加便捷，方便。

目前，酶標(biāo)免疫技術(shù)在臨床診斷得到廣泛應(yīng)用，首先將酶與抗原抗體相結(jié)合，制備成酶標(biāo)記的抗原或抗體。測定時，利用酶標(biāo)抗體（或酶標(biāo)抗原）與待測樣品中的抗原（或抗體）相結(jié)合，再借助標(biāo)記的酶催化特定反應(yīng)，測定出在酶-抗體-抗原結(jié)合物中的酶的含量。通過抗原抗體的量可以診斷某種疾病。在酶標(biāo)免疫測定中，最常使用的標(biāo)記酶是辣根過氧化物酶HRP和堿性磷酸酶AP。堿性磷酸酶AP一般有兩種來源，一種是從牛腸中提取的（Roche和BBI Solutions 可以提供牛腸中提取的AP），一種是微生物來源的（Roche和Sekisui Diagnostics 可以提供微生物來源的重組AP）。利用酶標(biāo)免疫測定，可以診斷腸蟲、毛線蟲、血吸蟲等寄生蟲病，以及瘧疾，麻疹，乙型肝炎等疾病。

目前，國內(nèi)體外診斷生產(chǎn)企業(yè)采購的診斷酶原料主要依賴于進(jìn)口。診斷酶的主要供應(yīng)商為Roche，TOYOBO，Sekisui Diagnostic（原Genzyme Diagnostic），AsahiKASEI，BBI Solutions等。近幾年，因為生化診斷市場競爭趨于紅海，為了控制上游成本，有些診斷企業(yè)開設(shè)原料研發(fā)部門，生產(chǎn)出的原料酶應(yīng)用于內(nèi)部生產(chǎn)，從而控制成本，控制原料質(zhì)量，控制上游原料供應(yīng)風(fēng)險。

一般體外診斷生產(chǎn)商需要采購大量的診斷酶作為原料，由于生物體內(nèi)酶的含量低，不能適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)的需要，酶的生產(chǎn)廠家很多采用微生物的發(fā)酵來制取，在適宜的條件下，選育出所需要的菌種，讓其進(jìn)行繁殖，通過發(fā)酵工藝獲得大量的酶。

酶發(fā)酵工藝圖示：

2.2 分子診斷酶、引物、探針等   

近年來，全球分子診斷市場增長快速，復(fù)合增長率高達(dá)11%，是體外診斷產(chǎn)業(yè)中增長最快的領(lǐng)域，也是未來最有潛力的發(fā)展方向之一。本小節(jié)主要對分子診斷產(chǎn)業(yè)鏈上游原料展開分析。診斷酶、引物、反轉(zhuǎn)錄酶和探針等是分子診斷上游的核心原料，目前國內(nèi)分子診斷企業(yè)原料采購主要依靠進(jìn)口，國際上分子診斷核心原料供應(yīng)商主要有Roche （KAPA systems），Thermofisher（Life Tech，ABI，Invitrogen etc.），Qiagen（Enzymetics），Meridian Life science，Sekisui Diagnostics（Former Genzyme Dianostics），Takara（Clonetech Labs）等，隨著國內(nèi)生物技術(shù)的快速發(fā)展，國內(nèi)的分子生物學(xué)生產(chǎn)企業(yè)（例如：菲鵬，近岸蛋白等）也陸續(xù)開發(fā)出應(yīng)用于分子診斷的酶。

分子診斷技術(shù)主要是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction簡稱PCR），核酸分子雜交技術(shù)和生物芯片技術(shù)。其中，PCR產(chǎn)品占據(jù)分子診斷領(lǐng)域的主要市場。  

    聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)原理憑借靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速診斷的特點(diǎn)榮獲93年諾貝爾化學(xué)獎，由于PCR可以進(jìn)行定性、定量檢測，因而可廣泛用于遺傳病基因、肝炎、細(xì)菌、病毒和腫瘤等檢測。因PCR在病原體檢測方面的獨(dú)特優(yōu)勢，成為分子生物學(xué)診斷的主流。參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種，分別是Taq DNA 聚合酶、引物、dNTP（dATP， dCTP, dGTP, dTTP, dUTP）、模板和緩沖液（其中含鎂離子）。PCR反應(yīng)中，DNA高溫時變性解鏈，低溫時又復(fù)性成雙鏈，設(shè)計引物作為啟動子，同時變化溫度控制DNA的變性和復(fù)性，加入DNA聚合酶和dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。在擴(kuò)增目的基因的過程中，溫度變化從50-90度，變化很大，然而DNA聚合酶不耐高溫，每次循環(huán)需要重新加入新的DNA聚合酶，用量大成本高，操作繁瑣，制約了PCR技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展。1973年我國臺灣科學(xué)家錢嘉韻從水生棲熱菌（Thermus aquaticus）中成功分離出了耐高溫的Taq DNA 聚合酶，簡稱Taq酶。該酶90度高溫不失活，不需要每次循環(huán)重新加入新的酶，大大簡化了PCR技術(shù)，降低了成本，使得PCR技術(shù)廣泛應(yīng)用并進(jìn)一步應(yīng)用于臨床診斷。    Taq酶主要分為三類，高特異性Taq酶，高保真Taq酶和高耐熱性Taq酶。高特異性Taq酶的代表是熱啟動Taq酶，是必需經(jīng)過高溫才能啟動的酶，在初始循環(huán)變性前熱啟動Taq酶沒有活性，不會產(chǎn)生非特異擴(kuò)增，大大提高了PCR擴(kuò)增的特異性。目前企業(yè)常用的熱啟動Taq酶是通過內(nèi)部改造的重組酶，如Qiagen公司的HotStar Taq酶，Sekisui Diagnostics公司的HS Taq 酶等，真正實(shí)現(xiàn)便利的熱啟動，無需別的輔助抑制物，使用更加方便高效。

    分子診斷對PCR高保真性要求很高，錯配率是檢驗高真性的一個標(biāo)準(zhǔn)，錯配率越低高真性越高，高保真Taq酶具有3’-5’核酸外切酶的活性，錯配途中可以切掉錯配的堿基，保證了擴(kuò)增的準(zhǔn)確性。目前市場上使用的高保真酶主要有兩類，一類是TAKARA（Clontech）公司生產(chǎn)的混合型高保真酶，就是將帶有Proofreading活性的酶與普通Taq酶混合。另一類是單一型的保真酶，具備更高的保真性，如Qiagen公司的ProofStart DNA聚合酶，NEB公司的Vent DNA聚合酶。NEB公司還提供高耐熱性Taq酶，如Vent和Deep Vent DNA聚合酶系列，對于有些模板變性溫度較高，需要時間較長，就需要此類高耐熱性Taq酶。

    幾乎所有的Taq酶都帶有相應(yīng)的反應(yīng)緩沖液，緩沖液的品質(zhì)對保證Taq酶特異性擴(kuò)增起的作用不容小覷。目前生產(chǎn)廠家一般有兩種Taq DNA聚合酶供應(yīng)，一種是從棲熱水生桿菌中提取的天然酶，一種是大腸桿菌合成的基因工程酶。一般來說一個典型的PCR反應(yīng)，所需要的酶量是2.5U（總反應(yīng)體積為100ul）。濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。

    實(shí)時熒光定量PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）廣泛應(yīng)用的一種變形。實(shí)時熒光定量PCR通過熒光染料或者熒光標(biāo)記的特異性探針，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時在線監(jiān)控反應(yīng)過程，最后結(jié)合相應(yīng)的軟件通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析。實(shí)時熒光定量PCR可以實(shí)時定量檢測致病病原體基因核酸，一般來說，它比化學(xué)發(fā)光、蛋白芯片等免疫學(xué)方法更具獨(dú)到優(yōu)勢。

實(shí)時熒光定量PCR標(biāo)記的方法有內(nèi)摻式染料（熒光染料SYBR Green I），序列特異性探針（Taqman Probe）和引物特異性探針（Amplifluor Probe）。SYBR Green使用方便，不必設(shè)計復(fù)雜的引物，成本低，靈敏度高，可以用于不同的模板，沒有序列特異性。Taqman探針對目標(biāo)序列有很高的特異性，所以特別適合SNP檢測，目前應(yīng)用非常廣泛。與普通PCR相比，實(shí)時熒光定量PCR全程監(jiān)控，定量準(zhǔn)確，引物和探針同時與模板特異性結(jié)合特異性高，熒光檢測靈敏度更高，無需跑膠自動化程度也更高。

   診斷酶作為體外診斷生產(chǎn)商的核心原料，對于生產(chǎn)成本，產(chǎn)品質(zhì)量和穩(wěn)定性有著決定性的影響。由于診斷酶技術(shù)門檻高，自主研發(fā)難度大，目前體外診斷生產(chǎn)企業(yè)主要進(jìn)口診斷酶，國際上主要的診斷酶生產(chǎn)廠家都有幾十年的歷史，酶產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，批間差小，但是存在價格高，貨期長等弊端。酶作為特殊蛋白質(zhì)維系生命過程，所以酶的研究對生命科學(xué)發(fā)展非常重要；酶作為生物催化劑在各個領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用，尤其是在醫(yī)療診斷尤其是在臨床診斷領(lǐng)域的應(yīng)用，對提高人們的健康生活水平具有重大意義。