熱門搜索：分會介紹 | 會員名單 | 行業(yè)資訊
第一節(jié) 引言
體外診斷產(chǎn)品的質(zhì)量很大程度上是由上游的核心原材料決定的。
廣義的原材料包括儀器上游的核心元部件和試劑上游的生物活性/非生物活性材料。狹義的診斷試劑原料一般僅指生化、免疫或分子診斷試劑的反應(yīng)體系原料，包括核心反應(yīng)體系、信號體系、載體，以及反應(yīng)環(huán)境等。其中，核心反應(yīng)體系原料如診斷酶、引物、抗原、抗體等，是體外診斷試劑產(chǎn)業(yè)上游最重要的戰(zhàn)略節(jié)點，其質(zhì)量是決定體外診斷試劑質(zhì)量的最重要因素。信號體系如膠體金、酶底物系統(tǒng)、發(fā)光物質(zhì)等是將不可見的生物反應(yīng)過程和結(jié)果變成可視、可讀的結(jié)果的實現(xiàn)環(huán)節(jié)。反應(yīng)體系載體如NC膜、酶標(biāo)板、磁珠等提供了生物化學(xué)反應(yīng)發(fā)生的場所，并因各種材料的迥異性能，使得診斷試劑具有快速、高通量、均相等豐富特性。反應(yīng)環(huán)境是由各種生物活性材料和精細(xì)化學(xué)原料，包括牛血清白蛋白、阻斷劑、氯化鈉、碳酸鈉和各種氨基酸以及有機酸等調(diào)配而成的體外診斷試劑緩沖溶液，為試劑的反應(yīng)排除干擾、為儲存提供了穩(wěn)定性，保障反應(yīng)得以順利進(jìn)行。
本章重點討論核心反應(yīng)體系原料、信號體系、載體，以及阻斷劑等。有機無機化學(xué)原料對診斷試劑品質(zhì)也有不可忽略的影響，但因原料本身的質(zhì)量控制和判斷相對簡單，本章不展開。
第二節(jié) 診斷試劑原料的國際發(fā)展?fàn)顩r
原料的重要性使得有能力為體外診斷工業(yè)提供創(chuàng)新、優(yōu)質(zhì)、穩(wěn)定、大批量的原料的公司異軍突起，越來越受到體外診斷試劑廠商的重視和青睞。不同于科研試劑供應(yīng)商動輒數(shù)十萬產(chǎn)品的“大而全”，體外診斷試劑原料供應(yīng)商往往“小而美”，這是行業(yè)特點決定的。首先，“原料”概念跨度較大，抗原抗體、酶底物、膜材微粒等，涉及完全不同的領(lǐng)域，原料供應(yīng)商窮究幾十年也往往只精通其中一個領(lǐng)域，比如HyTest主攻單抗，MBC和IIC專做多抗，Genzyme以酶為業(yè)，Millipore因膜聞名……。其次，目前被批準(zhǔn)使用于臨床檢驗的項目不過千余種（《醫(yī)療機構(gòu)臨床檢驗項目目錄2013版》收錄檢驗項目約1500個），從原料角度進(jìn)行方法學(xué)歸類，則無非化學(xué)反應(yīng)、酶底物反應(yīng)、抗原抗體反應(yīng)、PCR反應(yīng)等數(shù)種原理，因而，原料公司的產(chǎn)品數(shù)量都相對有限，以國內(nèi)產(chǎn)品種類數(shù)量最多、涉足領(lǐng)域最廣的體外診斷核心原料供應(yīng)商菲鵬為例，2016年財報顯示經(jīng)數(shù)十年的技術(shù)革新和發(fā)展，目前已擁有700余小類的抗原抗體產(chǎn)品——比起科研抗體供應(yīng)商，這十?dāng)?shù)年積累的產(chǎn)品數(shù)量可說是精選嚴(yán)選的產(chǎn)物。再次，體外診斷涉及的疾病范圍廣泛，傳染病、腫瘤、心血管、代謝等每一類疾病都代表獨立的學(xué)科，作為抗原抗體原料供應(yīng)商，只有對該疾病和疾病標(biāo)志物進(jìn)行長期、專注的研究，才能研發(fā)優(yōu)質(zhì)的原料應(yīng)用于疾病診斷，這進(jìn)一步使得免疫原料的源頭供應(yīng)商通常僅專精于少數(shù)幾個疾病領(lǐng)域，如HyTest擁有毋庸置疑的心血管原料第一品牌定位，BioVentix以Vit D聞達(dá)于業(yè)界，而Microbix則憑ToRCH抗原獨樹一幟。
當(dāng)然，隨著頻繁的并購活動，原料供應(yīng)商中也不乏“巨無霸”的身影，如Merck，BBI，ThermoFisher，Meridian等，產(chǎn)品線橫跨多個領(lǐng)域，為體外診斷工業(yè)提供更為完善的解決方案；還有一些公司，如Fitzgerald，Abcam等，擁有超長產(chǎn)品線，他們既服務(wù)于工業(yè)客戶，也服務(wù)于科研客戶。
2009-2016年國內(nèi)體外診斷市場規(guī)模的復(fù)合增速為16.60%，預(yù)計2016年達(dá)到370億元。如果按照診斷試劑原料市場規(guī)模約占體外診斷試劑市場規(guī)模10%左右計算，我國診斷試劑原料市場規(guī)模約37億元。
高速增長的全國體外診斷市場受到國際原料廠商的高度重視，Merck、Roche、東洋紡、HyTest等較早在國內(nèi)設(shè)立子公司，專為中國市場服務(wù)；2016年新進(jìn)入或正在設(shè)立中國子公司的有Medix、Meridian、BBI等。其他未進(jìn)入中國的原料企業(yè)，其產(chǎn)品在國內(nèi)也均可通過代理商如佰橋瑞景和雅為世紀(jì)較方便地獲得。而國內(nèi)的明星原料企業(yè)如菲鵬生物，2016年在新三板上市，年銷售額超過1.5億元人民幣，已然躋身國際品牌行列，共同為全國體外診斷試劑工業(yè)服務(wù)。
可以這么說，全國體外診斷工業(yè)，在核心原料這一環(huán)節(jié)，正與世界同步。
第三節(jié) 診斷試劑原料
一、 核心反應(yīng)體系（抗原、抗體、酶）
1. 抗原抗體
抗原抗體廣泛應(yīng)用于以免疫反應(yīng)為基本原理的診斷試劑中�？乖贵w反應(yīng)具有可逆性、最適比例、特異性和敏感性等特點。
（1）可逆性：抗原與抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物的過程是一種動態(tài)平衡，抗原抗體復(fù)合物的解離程度與抗體的親和力K值有關(guān)。高親和力抗體的抗原結(jié)合點與抗原的決定簇在空間構(gòu)型上非常適合，兩者結(jié)合牢固，不易解離。
（2）最適比例：在恒定量的抗體中加入遞增量的抗原形成免疫復(fù)合物（沉淀）的量見圖4.9-1。曲線的高峰部分是抗原抗體比例最合適的范圍，稱為等價帶（zone of equivalence）。在等價帶前后分別為抗體過剩帶和抗原過剩帶。如果抗原或抗體極度過剩，則無沉淀物形成，在免疫測定中稱為帶現(xiàn)象（zone phenomenon）�？贵w過量稱為前帶（prezone），抗原過量稱為后帶（postzone）。在用免疫學(xué)方法測定抗原時，應(yīng)使反應(yīng)系統(tǒng)中有足夠的抗體量，否則測得的量會小于實際含量，甚至出現(xiàn)假陰性。
（3）特異性：抗原抗體的結(jié)合實質(zhì)上只發(fā)生在抗原的抗原決定簇與抗體的抗原結(jié)合位點之間。由于兩者在化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型上呈互補關(guān)系，所以抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性。例如乙肝病毒中的表面抗原（HBsAg）、e抗原（HBeAg）和核心抗體（HBcAg），雖來源于同一病毒，但僅與其相應(yīng)的抗體結(jié)合，而不與另外兩種抗體反應(yīng)。抗原抗體反應(yīng)的這種特異性使免疫測定能在非常復(fù)雜的蛋白質(zhì)化合物（例如血清）中測定某一特定的物質(zhì)，而不需先分離待檢物。
但是這種特異性也不是絕對的。假使兩種化合物有著部分相同的結(jié)構(gòu)，在抗原抗體反應(yīng)中可出現(xiàn)交叉反應(yīng)。例如：絨毛膜促性腺激素（hCG）和黃體生成激素（LH）均由α和β兩個亞單位組成，其結(jié)構(gòu)的不同處在β亞單位，而兩者的α亞單位是同類的。用hCG免疫動物所得的抗血清中含有抗α-hCG和抗β-hCG兩種抗體，抗α-hCG抗體將與LH中的α酶位發(fā)生交叉反應(yīng)。在臨床檢驗中，如用抗hCG抗血清作為妊娠診斷試劑檢定尿液中hCG，只能用于hCG濃度較高的試驗，否則婦女生理性排泄入尿液中的微量LH將與之發(fā)生交叉反應(yīng)。因此在作為早孕診斷的試劑中必須應(yīng)用只對hCG特異的抗β-hCG，以避免與其它激素的交叉反應(yīng)的發(fā)生。
（4）敏感性
在測定血清中某一物質(zhì)的含量時，化學(xué)比色法的敏感度為mg/ml水平，酶反應(yīng)測定法的敏感度約為5~10μg/ml，免疫測定中凝膠擴散法和濁度法的敏感度與酶反應(yīng)法相仿。標(biāo)記的免疫測定的敏感度可提高數(shù)千倍，達(dá)ng/ml甚至pg/ml水平。
因此，抗原抗體反應(yīng)中原料的靈敏度、特異性、效價和親和力是決定試劑盒性能的關(guān)鍵因素，也是試劑生產(chǎn)商對原料性能考核的重點參數(shù)。
抗體，也叫免疫球蛋白（immunoglobulin），是一種能特異性結(jié)合抗原的糖蛋白，而抗原則是在易感染動物體內(nèi)引發(fā)抗體產(chǎn)生的物質(zhì)�？贵w的結(jié)構(gòu)如圖4.9-2所示，一個抗體分子上的兩個抗原結(jié)合部位是相同的，位于兩臂末端稱抗原結(jié)合片段（antigen-binding fragment，F(xiàn)ab）�！癥”的柄部稱結(jié)晶片段（crystalline fragment，F(xiàn)C），糖結(jié)合在FC上。另外，F(xiàn)C片段具有抗原性，可被其他抗體或抗體片段所識別。
根據(jù)“Y”形結(jié)構(gòu)的數(shù)量和重鏈種類的不同，哺乳動物體內(nèi)的抗體可以分為5類：IgG、IgM、IgA、IgD、IgE。其中IgM是5聚體，而IgA有二聚體三聚體等多種形式。各類抗體在生物學(xué)特性、功能區(qū)域以及結(jié)合不同抗原的能力上有所不同，這里不再贅述。值得一提的是目前在免疫學(xué)檢測試劑開發(fā)中，主要使用的抗體為IgG，IgM次之。
關(guān)于抗體的應(yīng)用，早在幾百年前便有記載。公元16世紀(jì)我國已有關(guān)于種痘預(yù)防天花的記載；18世紀(jì)后葉，英國人Jenner也通過接種牛痘預(yù)防天花。而隨著疫苗的應(yīng)用，抗體的靶向作用也被應(yīng)用到了更多領(lǐng)域。1890年，白喉毒素的發(fā)現(xiàn)，開創(chuàng)了抗體制藥領(lǐng)域；1975年，來源于小鼠B淋巴雜交瘤細(xì)胞的第一代單克隆抗體誕生，使得抗體作為疾病診斷和治療的應(yīng)用范圍有了更大范圍的擴展。
隨著抗體在疾病診斷方面的應(yīng)用發(fā)展，目前主要應(yīng)用的抗體以鼠、羊和兔子等動物來源的單克隆抗體和多克隆抗體為主。關(guān)于單抗和多抗，其定義如下：抗原上可以引起機體產(chǎn)生抗體的分子結(jié)構(gòu)叫做抗原決定簇，也稱為抗原表位。一個抗原可以有許多不同的抗原決定簇，因此，機體也可以產(chǎn)生多種不同的抗體。由單一B淋巴細(xì)胞克隆產(chǎn)生的高度均一、僅識別某一特定抗原表位的抗體，稱為單克隆抗體。而由多個B淋巴細(xì)胞克隆產(chǎn)生的、受到多種抗原決定簇刺激并可以與多種抗原表位結(jié)合的抗體就是多克隆抗體。從某種角度而言，多抗是多種單抗的混合物。
除了定義不同之外，兩者在制備上也有區(qū)別。經(jīng)過特定抗原處理過的B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞通過細(xì)胞融合的方法得到雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)HAT培養(yǎng)基篩選、ELISA檢測效價后就可得到陽性克隆株，最后進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)或?qū)⒓?xì)胞注入到動物（一般為balb/c小鼠）腹腔中用腹水培養(yǎng)，收集上清/腹水純化后就能得到單克隆抗體。而制備多克隆抗體工藝相比于單克隆抗體則簡單許多，只需將抗原（純度越高越好）直接注入到動物體內(nèi)進(jìn)行免疫，經(jīng)過3~4次免疫，ELISA測其效價合格后，收集血液離心得到上清，純化后即能得到多克隆抗體。因此制備多克隆抗體的周期相比單克隆抗體要短，而且首次制備價格也比單抗要低。
在應(yīng)用方面，單抗和多抗都有各自鮮明的特點與優(yōu)勢。單克隆抗體的特異性高，一旦制備成功就可以永續(xù)的生產(chǎn)完全一致的抗體，因此可以對其特異性進(jìn)行全面、系統(tǒng)地驗證。但如果所識別的抗原表位被破壞，實驗的結(jié)果將會受到很大的影響，這也是單抗的缺點之一。而多克隆抗體的特異性較差，即使是使用相同的抗原制備多抗，不同批次間也會存在差異，因而在特異性、一致性方面有很大的局限。所以在用多抗做免疫檢測時，更容易造成本底過高的現(xiàn)象。雖然多抗存在交叉反應(yīng)的問題，但由于多抗識別多個抗原表位，即使是有少數(shù)幾個抗原表位被破壞或者抗原構(gòu)象改變，實驗的結(jié)果也不會受到影響。因此在相同條件下，使用多抗可以提高檢測的靈敏度，對于豐度偏低的蛋白也更容易檢出。
除了完整的抗體蛋白之外，抗體的功能性片段也被廣泛應(yīng)用于疾病檢測領(lǐng)域�？贵w的功能性片段是指經(jīng)過特定的蛋白酶酶切之后獲得的功能性片段�？贵wFC段由于具有抗原性，可被其他抗體所識別，如小鼠單克隆抗體可被類風(fēng)濕因子、HAMA等異嗜性抗體所識別，從而影響檢測結(jié)果。因此目前在體外診斷領(lǐng)域中去除抗體FC段的主要目的是去除異嗜性抗體引起的非特異性反應(yīng)。常用的功能性片段有Fab（由木瓜蛋白酶酶切而得）和F(ab’)2（由胃蛋白酶酶切而得）。
由于動物源性的抗體在疾病診斷應(yīng)用中往往會受到不同種異嗜性抗體的影響，因此在未來，嵌合抗體（人源化）、基因工程重組抗體將會成為抗體發(fā)展的主要趨勢。嵌合抗體是將不同物種的抗體片段進(jìn)行組合后獲得的改造抗體，如將小鼠抗體的FC片段替換為人抗體FC片段，這樣便可以免除HAMA的影響。重組抗體是通過經(jīng)免疫淋巴細(xì)胞而提取的抗體輕鏈和重鏈基因片段（mRNA），經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后導(dǎo)入基因工程載體，然后進(jìn)行體外表達(dá)。該方法獲得的抗體，在產(chǎn)量、生產(chǎn)周期和多樣性等方面相比于傳統(tǒng)的雜交瘤方法均有明顯優(yōu)勢。此外，該方法還可以跳過免疫系統(tǒng)，在不經(jīng)過免疫動物的情況下直接獲得特定的抗體。關(guān)于單克隆抗體，多克隆抗體和重組抗體的對比如下表。
在疾病診斷領(lǐng)域，抗體是體外診斷試劑的核心原料。根據(jù)技術(shù)平臺和檢測方法的不同，應(yīng)用也略有不同。目前主要的應(yīng)用平臺有放射免疫分析、酶聯(lián)免疫分析、化學(xué)發(fā)光免疫分析、膠體金側(cè)向?qū)游�、熒光免疫�?cè)向?qū)游�、免疫比濁、蛋白免疫印跡、免疫組化和直接酶聯(lián)免疫分析等。在不同平臺中，抗體通過修飾偶聯(lián)于不同的標(biāo)記物和固相介質(zhì)。其中，抗體與標(biāo)記物組成的偶聯(lián)物稱為檢測系統(tǒng)（產(chǎn)生信號），而抗體與固相介質(zhì)的偶聯(lián)物則稱為分離系統(tǒng)。這兩個系統(tǒng)最終形成了完整的體外診斷免疫學(xué)試劑。關(guān)于標(biāo)記物，目前常用的有放射性同位素標(biāo)記、酶標(biāo)記（辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶等）、直接熒光標(biāo)記、時間分辨熒光標(biāo)記、直接化學(xué)發(fā)光（吖啶酯）、生物發(fā)光標(biāo)記、電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、磷光標(biāo)記、微球標(biāo)記、鏈霉親和素-生物素標(biāo)記等。關(guān)于固相介質(zhì)，目前主要應(yīng)用的有聚苯乙烯微孔板、玻璃/聚苯乙烯乳膠微球、磁微粒、硝酸纖維膜等。
關(guān)于偶聯(lián)的方法，主要有靜電吸附、生物偶聯(lián)（鏈霉親和素-生物素、二抗、ProteinA/G等）和化學(xué)偶聯(lián)。在主要的三種偶聯(lián)方法中，最重要的是化學(xué)偶聯(lián)。主要原理是通過將抗體分子中的活性基團與偶聯(lián)物的活性功能基團通過化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行交聯(lián)，因此制備工藝和反應(yīng)途徑會對抗體活性乃至整個試劑的性能產(chǎn)生重要的影響。目前應(yīng)用的主要活性基團有氨基、巰基、羧基和糖基等。針對于蛋白質(zhì)，主要的交聯(lián)反應(yīng)有過碘酸鈉法、同型雙功能交聯(lián)劑法、異型雙功能交聯(lián)劑法等。而針對于半抗原等小分子，主要交聯(lián)方法有碳二亞胺法、碳二亞胺-NHS法、混合酸酐法和曼尼希反應(yīng)等。關(guān)于不同交聯(lián)方法的具體反應(yīng)原理，可參考相關(guān)書籍，這里不再贅述。
在不同的檢測方法中，抗體起到了多種關(guān)鍵的功能作用。目前常用的檢測方法有雙抗體夾心法、雙抗原夾心法、間接法、抗體競爭法、抗原競爭法和捕獲法等。在雙抗體夾心法中，待測物為抗原（蛋白質(zhì)和多肽為主），捕獲抗體和檢測抗體分別與固相介質(zhì)和標(biāo)記物偶聯(lián)，通過與抗原形成三明治免疫復(fù)合物從而實現(xiàn)對抗原的檢測；在雙抗原夾心法中，待測物為抗體，因此抗體在試劑盒中扮演的角色為校準(zhǔn)品或質(zhì)控品，不同抗原分別與固相介質(zhì)和標(biāo)記物偶聯(lián)，通過與待測抗體形成三明治免疫復(fù)合物從而實現(xiàn)對抗體的檢測；在間接法中，待測物為抗體，抗原與固相介質(zhì)進(jìn)行偶聯(lián)對待測抗體進(jìn)行捕獲，抗人IgG特異性抗體作為檢測抗體；在抗原競爭法中，待測物為抗原（通常是小分子抗原，主要原因在于小分子上至多只有一個抗原決定簇，因此不能形成夾心復(fù)合物），捕獲抗體與固相介質(zhì)偶聯(lián)，抗原和待測抗原競爭性地被捕獲抗體捕獲，從而實現(xiàn)對抗原的檢測；在抗體競爭法中，待測物為抗體，抗原與固相介質(zhì)偶聯(lián)，抗體與標(biāo)記物偶聯(lián)，與待測抗體競爭性地與捕獲抗原反應(yīng)，從而實現(xiàn)對抗體的檢測，同時，抗體還可作為校準(zhǔn)品和質(zhì)控品；在捕獲法中，待測物為IgM抗體，抗IgM抗體作為捕獲抗體與固相介質(zhì)偶聯(lián)，IgM對應(yīng)的抗原的特異性抗體作為檢測抗體與標(biāo)記物偶聯(lián)，通過形成抗IgM抗體-IgM-IgM抗原-抗IgM抗原特異性抗體的復(fù)合物對待測IgM進(jìn)行檢測。除上述的經(jīng)典免疫學(xué)檢測方法外，免疫比濁法也是目前體外診斷行業(yè)中應(yīng)用非常廣泛的方法。該方法中，抗體與膠乳微球進(jìn)行偶聯(lián)，當(dāng)待測物中有抗原存在時，會引起膠乳溶液的濁度變化，從而實現(xiàn)對抗原的檢測。關(guān)于不同檢測方法的詳細(xì)原理，這里不再贅述，可參考其他相關(guān)書籍。
除上述的常見方法外，蛋白免疫印跡、免疫組化和直接酶聯(lián)免疫分析在科研領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，在體外診斷領(lǐng)域也有一定程度的應(yīng)用。其中抗體作為檢測抗體可直接與待測抗原反應(yīng)。
如前所述，作為主要的核心原材料，抗體對于整個免疫檢測分析系統(tǒng)有著至關(guān)重要的影響。因此除去試劑制備工藝外，抗體自身的性能可在很大程度上決定著檢測試劑的質(zhì)量。目前，衡量抗體質(zhì)量的技術(shù)指標(biāo)仍然沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，但是可以大概總結(jié)為活性/效價/親和力、線性范圍、特異性、純度、重復(fù)性/批間差和穩(wěn)定性等。
活性/效價/親和力，是反應(yīng)抗體與抗原之間反應(yīng)性的直接指標(biāo)，但是目前關(guān)于該指標(biāo)的測定沒有標(biāo)準(zhǔn)和統(tǒng)一方法。現(xiàn)階段，大多數(shù)抗體供應(yīng)商對于效價的檢測是在ELISA平臺上通過重組或者天然抗原對抗體進(jìn)行測試，通過信號值對抗體的活性進(jìn)行考察。檢測方法以直接ELISA為主，即抗原包被于聚苯乙烯微孔板后，用標(biāo)記的抗體直接與抗原進(jìn)行反應(yīng)。這里值得注意的是，并不是高親和力的抗體就一定對應(yīng)為高性能的免疫檢測分析系統(tǒng)。針對不同種類的標(biāo)志物，對于親和力的要求有一定區(qū)別，具體討論將在線性指標(biāo)中詳細(xì)展開討論。
線性范圍是指分析方法在給定范圍內(nèi)獲取與樣品中待測物濃度成正比的試驗結(jié)果的能力。該指標(biāo)是反映分析方法檢測范圍和準(zhǔn)確性的直接指標(biāo)。線性范圍的測試是在抗體配對組成基本的免疫檢測分析系統(tǒng)后進(jìn)行的，因此可以理解為是抗體性能的間接指標(biāo)。正如前文所述，高親和力抗體并不代表高性能試劑，針對不同種類的標(biāo)志物，對于親和力的需求有一定差異。當(dāng)待測標(biāo)志物在外周循環(huán)中存在的濃度范圍很寬時，如果使用了高親和力的抗體，那么會導(dǎo)致鉤狀效應(yīng)的過早出現(xiàn)（鉤狀效應(yīng)或HOOK效應(yīng)，是指由于抗原抗體比例不合適而導(dǎo)致假陰性的現(xiàn)象，產(chǎn)生的主要原因是當(dāng)抗體親和力很強，同時抗原濃度很高時，可用抗體全部被抗原中和，導(dǎo)致了反應(yīng)提前進(jìn)入平臺期甚至信號下降。），從而嚴(yán)重影響到了試劑盒的線性范圍，導(dǎo)致了高濃度樣本被嚴(yán)重低估，甚至可能導(dǎo)致醫(yī)療事故的產(chǎn)生。典型的寬濃度范圍的標(biāo)志物，如人絨毛膜促性腺激素(hCG)、肌紅蛋白(MYO)和C反應(yīng)蛋白（CRP）等。但是對于微量存在即可提示某種疾病的且濃度范圍并不是很寬的標(biāo)志物而言，高親和力的抗體便顯得尤為重要，因為低值樣本的檢出能力或稱為靈敏度直接與抗體親和力掛鉤。典型的低濃度具有重要意義的標(biāo)志物，如肌鈣蛋白（TnI，目前市場上已經(jīng)有超敏肌鈣蛋白檢測試劑了）和降鈣素原（PCT）等，均對試劑靈敏度有很高要求。
特異性指抗體單一性識別某種特定抗原的能力。該指標(biāo)雖然不直接影響試劑整體反應(yīng)性，但是卻對于檢測結(jié)果有著很重要的影響。外周循環(huán)中除了待測標(biāo)志物之外，還存在許多其他分子。這些分子可能和待測物具有類似的結(jié)構(gòu)或構(gòu)象；也可能與待測物存在共同的氨基酸片段。而抗體所識別的位點主要分為線性表位和構(gòu)象表位。當(dāng)抗體所識別的線性表位的氨基酸序列或者構(gòu)象表位的結(jié)構(gòu)域存在于其他分子中時，便會導(dǎo)致測試結(jié)果的假陽性或者假陰性。這既是抗體特異性差所導(dǎo)致的結(jié)果，也可以理解為抗體識別的抗原表位不夠?qū)Ｒ凰�。不同分子間具有相同的抗原表位往往見于同源蛋白中，如心肌肌鈣蛋白和骨骼肌肌鈣蛋白直接存在多段相同的氨基酸序列；促甲狀腺激素、促卵泡生成激素、促黃體生成激素和人絨毛膜促性腺激素存在共同的α亞基等。肌紅蛋白與血紅蛋白均具有血紅素核心、地高辛和洋地黃毒苷具有類似的糖苷結(jié)構(gòu)、糖抗原CA50和CA19-9均有Lewis-A糖抗原等。因此，抗體的識別位點是決定抗原特異性的關(guān)鍵性因素。
關(guān)于純度，在體外診斷試劑制備過程中，往往需要先將抗體進(jìn)行修飾，當(dāng)抗體純度不夠時，會導(dǎo)致其他雜蛋白被一起偶聯(lián)于固相介質(zhì)或者標(biāo)記物上，從而影響了試劑的反應(yīng)性能，如特異性、反應(yīng)信號、背景值等�？贵w的純度通常由細(xì)胞培養(yǎng)工藝和抗體純化工藝所決定。使用無血清培養(yǎng)基可以很大程度上去除血清培養(yǎng)基中帶來的雜質(zhì)蛋白，而穩(wěn)定精密的蛋白質(zhì)純化工藝則可以進(jìn)一步將抗體中絕大多數(shù)雜質(zhì)去除。目前，抗體的純度測定主要有SDS-PAGE電泳后的條帶掃描和HPLC測試等。值得一提的是，目前國內(nèi)抗體生產(chǎn)廠家普遍存在的批間差問題，可以嘗試從細(xì)胞培養(yǎng)和蛋白質(zhì)純化控制方面著手改善。
重復(fù)性/批間差，是指每批次產(chǎn)品的可重復(fù)性。之前所述的一系列抗體性能對于體外診斷試劑的性能有直接影響，而重復(fù)性則是保證體外診斷試劑降低批間差異并且穩(wěn)定生產(chǎn)的前提條件。另外，如前所述，重復(fù)性和生產(chǎn)工藝密切掛鉤，因此也是體現(xiàn)抗體質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)。
穩(wěn)定性是指在特定的儲存條件下，一定時間內(nèi)抗體保持其活性的能力。值得注意的是，這里所指出的穩(wěn)定性僅代表抗體在進(jìn)行修飾/偶聯(lián)之前的穩(wěn)定性�？贵w在進(jìn)行修飾后，結(jié)構(gòu)會根據(jù)工藝的不同產(chǎn)生的不同的變化，而后續(xù)的穩(wěn)定性也很程度上取決于制備工藝，在制備成半成品試劑之后的穩(wěn)定性并不能代表抗體的真實穩(wěn)定性�？贵w的保存條件對于抗體的穩(wěn)定性至關(guān)重要，目前多數(shù)供應(yīng)商提供的抗體的儲存條件為4或-20℃；常規(guī)抗體的稀釋液大多數(shù)為不含有其他蛋白和保護(hù)劑的緩沖液（抗體中若含有其他蛋白或者保護(hù)劑，會影響抗體的后續(xù)偶聯(lián)）。關(guān)于37℃下的加速穩(wěn)定性，目前大多數(shù)體外診斷生產(chǎn)公司傾向于使用37℃的加速破壞試驗以模擬抗體的長期穩(wěn)定性。其原理主要基于阿倫尼烏斯的經(jīng)驗公式推理而得，但是實際上加速穩(wěn)定性并不能體現(xiàn)抗體的真實穩(wěn)定性，其參考意義并不大。
隨著我國體外診斷行業(yè)的迅速發(fā)展，相應(yīng)的抗體產(chǎn)業(yè)也在迅速增長。但是由于我國相關(guān)行業(yè)起步較晚，因此國內(nèi)抗體制造行業(yè)依然處于相對落后的階段�，F(xiàn)階段，國內(nèi)大多數(shù)免疫檢測試劑依然以使用進(jìn)口原料為主。目前主要的抗原抗體進(jìn)口廠商有HyTest、Medix、Meridian和Biospacific等，這些公司均有著數(shù)十年的發(fā)展歷史，對于抗體的研發(fā)生產(chǎn)和質(zhì)量管理均有著系統(tǒng)化的控制。國內(nèi)著名的原料生產(chǎn)企業(yè)有菲鵬等。隨著全國體外診斷試劑行業(yè)的不斷發(fā)展，中國市場越來越受到國際原料廠商的重視，可以說，除了少數(shù)因?qū)＠蛱毓┫拗撇荒苌唐坊N售的原料外，國內(nèi)IVD廠家與國際巨頭在原料的獲取渠道上已沒有明顯差距。
抗體的質(zhì)量控制是保證體外診斷試劑質(zhì)量的重要環(huán)節(jié)。目前，關(guān)于抗體質(zhì)量控制尚沒有國際公認(rèn)的檢驗標(biāo)準(zhǔn)。不同的原料生產(chǎn)廠商的出廠檢驗也略有差異。其中，主要的檢驗指標(biāo)有外觀、純度、濃度、分子量、活性、等電點等。此外，除上述常見的質(zhì)檢參數(shù)外，根據(jù)用戶需求不同，可能會進(jìn)行更多特殊的檢測，如手性測試、質(zhì)譜和糖譜測試等，這里不再贅述。
關(guān)于外觀，一般情況下純化后且沒有雜質(zhì)的單抗通過肉眼觀察基本為均一澄清的溶液。而純化工藝出現(xiàn)問題，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性等則會引起溶液渾濁、蛋白質(zhì)聚集沉淀等現(xiàn)象的產(chǎn)生。部分特殊抗體或者多抗可能不可避免地會出現(xiàn)輕微的沉淀或者渾濁，供應(yīng)商一般會加以說明。此外，抗體凍干粉基本為白色粉末。關(guān)于純度，如前所述是抗體重要的性能指標(biāo)。目前的檢測方法基本為SDS-PAGE電泳后的條帶掃描和HPLC檢測。理論上，抗體純度越高，其偶聯(lián)效率和活性就越高。對于不同生產(chǎn)批次抗體的純度控制，是體現(xiàn)產(chǎn)品質(zhì)量非常重要的一環(huán)。關(guān)于濃度，抗體的濃度對于抗體偶聯(lián)具有重要的指導(dǎo)意義，是計算交聯(lián)劑分子比例的關(guān)鍵參數(shù)。主要測定方法為Lowry法和OD280nm光吸收法等。目前，對于濃度的控制并沒有嚴(yán)格要求，每次純化后所獲得濃度差異屬于正�，F(xiàn)象。針對目前大多數(shù)的抗體偶聯(lián)工藝，濃度高于2mg/mL可基本滿足要求。另外，若抗體濃度過低可以通過透析或者超濾進(jìn)行濃縮；若濃度過高則可以用緩沖液進(jìn)行稀釋。關(guān)于分子量，目前體外診斷試劑所使用的抗體主要為IgG抗體，通過還原性SDS-PAGE電泳可以看到重鏈和輕鏈的電泳條帶，從而根據(jù)其位置判斷重鏈輕鏈的分子量。理論上，IgG重鏈的分子量約為55 KD左右，輕鏈約為25 KD左右，不同IgG之間可能會存在細(xì)微差異。若分子量差異較大，則提示抗體構(gòu)象可能遭到了破壞。關(guān)于活性，對每一批生產(chǎn)出的抗體進(jìn)行活性測試，是反映批間差異最直接的指標(biāo)。細(xì)胞株保存、傳代、培養(yǎng)、純化工藝的過程控制，都會對抗體活性產(chǎn)生重要影響。因此活性差異的控制可以理解為是抗體質(zhì)量控制的核心環(huán)節(jié)。目前，關(guān)于抗體活性測試的方法，主要是通過抗原與抗體反應(yīng)的信號值來進(jìn)行判斷，反應(yīng)平臺以ELISA為主。關(guān)于等電點，在抗體偶聯(lián)時，pH值是影響偶聯(lián)反應(yīng)的重要參數(shù)，而pH設(shè)定的依據(jù)則是根據(jù)抗體等電點。一般情況，在沒有經(jīng)過任何特殊修飾的情況下，不同抗體等電點差異不大。另外，隨著蛋白質(zhì)保存時間的推移，等電點可能會出現(xiàn)一定程度的偏移，因此等電點的測試對于質(zhì)量控制并非關(guān)鍵性因素。
上述討論內(nèi)容為目前原料供應(yīng)商對于原料的質(zhì)控參數(shù)，而對于生產(chǎn)過程的控制則是獲得理想質(zhì)控參數(shù)的前提條件。根據(jù)抗體整個生產(chǎn)流程，可以將過程控制分為原料質(zhì)量控制、細(xì)胞庫質(zhì)量控制和生產(chǎn)純化質(zhì)量控制三個環(huán)節(jié)。首先，高質(zhì)量的原料是獲得高質(zhì)量產(chǎn)品的保障，其中包括對于動物源品質(zhì)的控制、培養(yǎng)基質(zhì)量的控制、生物安全性檢測等。由于行業(yè)競爭激烈，目前部分生產(chǎn)廠商為了壓縮生產(chǎn)成本從而降低了原料的質(zhì)量控制，這也是我國目前抗體生產(chǎn)行業(yè)質(zhì)量參差不齊的重要因素。其次關(guān)于細(xì)胞庫質(zhì)量控制，細(xì)胞庫的系統(tǒng)化管理、合理的細(xì)胞儲存、傳代、培養(yǎng)是保證高質(zhì)量抗體的前提。雜交瘤細(xì)胞在數(shù)次傳代后會出現(xiàn)活力逐步下降現(xiàn)象，當(dāng)細(xì)胞活力不足時會導(dǎo)致所生產(chǎn)的抗體活性大打折扣。另外，若細(xì)胞株保存不善受到污染，將會造成不可設(shè)想的嚴(yán)重后果。因此細(xì)胞株科學(xué)的保存、復(fù)蘇及傳代是非常必要的。關(guān)于生產(chǎn)和純化，目前單克隆抗體的生產(chǎn)方式主要分為體內(nèi)培養(yǎng)和體外培養(yǎng)兩種。體內(nèi)培養(yǎng)是通過小鼠腹水培養(yǎng)而得，而體外培養(yǎng)則是通過生物反應(yīng)器而得。兩種培養(yǎng)方式均對原料有著很高的要求，同時，在培養(yǎng)過程中細(xì)胞培養(yǎng)工藝的控制也十分重要。值得一提的是，由于動物保護(hù)問題和動物個體間的潛在差異，在未來體外培養(yǎng)生產(chǎn)抗體可能會成為主要的生產(chǎn)方式。在獲得培養(yǎng)產(chǎn)物后（體內(nèi)培養(yǎng)為小鼠腹水、體外培養(yǎng)為懸浮培養(yǎng)液），通過一定的純化步驟便可獲得最終的抗體。目前純化方式主要為親和層析和離子交換層析，對于單抗而言，主要以protein A/G 的親和層析為主；而對于多抗，則以高純度的抗原親和層析為主。為進(jìn)一步獲得更高純度的抗體，則可以選擇在親和層析之前進(jìn)行離子交換層析。在純化過程中，保證各項參數(shù)和原料的穩(wěn)定是降低純化后抗體的批間差的重要因素。此外，不同抗體在使用同樣純化工藝純化時，所得的產(chǎn)物可能會出質(zhì)量差異。因此，對于不同的抗體選擇針對性的純化方式是非常重要且必須的。
抗體經(jīng)過出廠質(zhì)檢合格并到達(dá)體外診斷試劑生產(chǎn)商手中后，根據(jù)我國體外診斷試劑生產(chǎn)及質(zhì)量控制技術(shù)的指導(dǎo)原則，需要對抗體進(jìn)行入庫檢定。一般情況下，質(zhì)檢的指標(biāo)主要包括：外觀——肉眼觀察，大部分生物原料為澄清均一的液體，不含異物、渾濁或搖不散的沉淀或顆粒；或為白色粉末且不含有其他雜質(zhì)；特殊抗體應(yīng)具備相應(yīng)外觀標(biāo)準(zhǔn)。純度和分子量——主要方法是SDS-PAGE電泳后經(jīng)考馬斯亮藍(lán)或者銀染色法進(jìn)行染色，然后對條帶進(jìn)行掃描分析。此外，高效液相層析也可以用于純度和分子量測定。蛋白濃度——主要測定方法為Lowry法、OD280nm光吸收法和雙縮脲法等。需要注意的是，不同方法學(xué)之間的結(jié)果存在一定差異，因此建議可以采取與原料廠商一致的方法進(jìn)行驗證。效價——一般在相應(yīng)試劑平臺上通過待測抗原進(jìn)行測定。功能性——除上述抗體固有的性質(zhì)之外，功能性結(jié)果可以直接反應(yīng)該原料用于實際生產(chǎn)的效果。一般考查使用該原料的試劑的靈敏度、特異性、穩(wěn)定性以及和上一批的平行對照等。這里值得指出的是，為了更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)貙贵w批間差異進(jìn)行驗證，對于合格抗體的留樣是非常有必要的。此外，還可根據(jù)實際情況定制或修改相應(yīng)的其他功能性質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)。
最后，關(guān)于抗體性能和質(zhì)量與試劑性能和質(zhì)量的關(guān)系。好的抗體是能做出好的試劑的前提，高品質(zhì)抗體在最適的試劑制備條件下能夠發(fā)揮出最佳性能。但是抗體在經(jīng)過修飾偶聯(lián)后形成最終的免疫檢測分析系統(tǒng)則需要經(jīng)過多種復(fù)雜工藝，其中任何一環(huán)的變化都會對最終的試劑性能產(chǎn)生影響。目前，我國體外診斷行業(yè)處于快速發(fā)展階段，大量試劑質(zhì)量已臻完善，但仍有許多項目或平臺的制備工藝需不斷優(yōu)化及驗證�？贵w與試劑制備工藝在優(yōu)秀的診斷試劑體系中相輔相成，對特定工藝而言，公認(rèn)的好抗體卻可能是“汝之蜜糖，彼之砒霜”，廣泛篩選最適抗體是提升國產(chǎn)試劑質(zhì)量和性能的關(guān)鍵一環(huán)。
在我國體外診斷行業(yè)快速發(fā)展的過程中，我們已經(jīng)取得了巨大的成就，但與國際巨頭之間仍有不小的差距。對于我國抗體生產(chǎn)廠商而言，需要更加系統(tǒng)且嚴(yán)謹(jǐn)?shù)卣J(rèn)識抗體的質(zhì)量控制，從原材料到最后的生產(chǎn)純化都必須嚴(yán)格把關(guān)，為全國體外診斷試劑廠商做好堅實后盾，共同推動我國體外診斷行業(yè)走上更加健康的發(fā)展道路。
掃描下載
掃描關(guān)注
掃描關(guān)注
掃描關(guān)注
掃描關(guān)注郵政編碼：200052 電話：021-63800152 傳真：021-63800151 京ICP備15010734號-10 技術(shù):網(wǎng)至普網(wǎng)站建設(shè)