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在《IVD注冊資料大解密丨定性檢測試劑干擾評估實驗設(shè)計探討》中我們探討了干擾評估實驗設(shè)計，此類實驗屬于分析特異性性能評估實驗范疇；分析特異性實驗一般包括干擾和交叉反應(yīng)研究。小編在此篇中和大家探討一下交叉反應(yīng)的定義以及其研究方法。

01

什么是交叉反應(yīng)

交叉反應(yīng)，在一般意義上，是一個被觀察的試劑的反應(yīng)，它引起的反應(yīng)超出預(yù)期的主要反應(yīng)。這對任何類型的檢測或化驗都有影響，包括醫(yī)學(xué)診斷測試，可能是假陽性的一個原因。例如檢測核酸物質(zhì)的試劑當(dāng)遇到來自同源區(qū)域、偽基因或其他類型的交叉反應(yīng)序列時可能導(dǎo)致錯誤的分析物檢測，產(chǎn)生假陽性結(jié)果。此外患者標(biāo)本的交叉污染將錯誤的序列引入檢測，從而可能導(dǎo)致假陽性和假陰性結(jié)果。

02

常見交叉反應(yīng)物質(zhì)

一般包括分析物的結(jié)構(gòu)類似物、具有同源性序列的核酸片段、檢測范圍外的型別；

易引起相同或相似的臨床癥狀的其他病原體、相同或相似的臨床癥狀出現(xiàn)時，體內(nèi)易升高的其他蛋白；

采樣部位正常寄生或易并發(fā)的其他微生物，包含近緣微生物。

另外由于產(chǎn)品原材料設(shè)計可能引入的交叉反應(yīng)。如病原體抗體檢測試劑采用基因重組抗原，應(yīng)增加對異源物質(zhì)如重組基因及表達(dá)宿主的特異性抗體的交叉反應(yīng)評價；如采用小鼠源性單克隆抗體作為主要原材料，應(yīng)注意HAMA可能對檢測造成的影響。

03

研究方法

建議選擇高濃度交叉反應(yīng)物水平進行驗證，細(xì)菌或者真菌的最低濃度為10? CFU/mL；病毒的最低濃度為10? PFU/mL；人野生型DNA至少包含1000 ng/μL野生核酸樣本。

對于核酸檢測試劑

當(dāng)遇交叉反應(yīng)物難以獲得，如病原體難以培養(yǎng)或基因型頻率低時，可采用核酸樣本進行交叉反應(yīng)的驗證。此時應(yīng)將核酸樣本視為實際使用過程中參與檢測反應(yīng)的核酸樣本，根據(jù)說明書的要求配制反應(yīng)體系，進行檢測。

對于血清學(xué)檢測試劑

用于交叉反應(yīng)研究的抗體類型應(yīng)與待測目的的抗體類型相同，如檢測病原病原體特異性IgG抗體，應(yīng)研究與其他相關(guān)病原體特異性IgG抗體的交叉反應(yīng)

04

示例

檢測人EGFR基因突變的試劑（cobas?EGFR）的交叉反應(yīng)實驗設(shè)計

cobas?EGFR檢測的特異性通過檢測肺部相關(guān)微生物和包含EGFR同源物的人工合成的質(zhì)粒，其中EGFR同源物為與cobas?EGFR檢測范圍內(nèi)的 EGFR外顯子18、19、20和21中的序列相似物，來自HER2、HER3和HER4基因區(qū)域的序列。

4.1 EGFR同源性序列

在提取的DNA中加入基因拷貝數(shù)相當(dāng)于50ng/PCR的EGFR同源質(zhì)粒DNA，檢測結(jié)果顯示上述同源序列(EGFR/HER1, HER2, HER3 and HER4)不與試劑盒發(fā)生交叉反應(yīng)。對照組不包括質(zhì)粒DNA。結(jié)果表明，在有無加入HER基因質(zhì)粒DNA的情況下，所有20個測試的FFPET樣本觀察到的突變均與通過測序確定的預(yù)期突變相符。此外，對EGFR 19外顯子突變L747S進行交叉反應(yīng)性檢測。結(jié)果表明，cobas?EGFR測試與EGFR 19外顯子突變L747S交叉反應(yīng)。

4.2肺部相關(guān)微生物

在組織裂解過程中，當(dāng)將肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌加入含有野生型和突變型EGFR序列的樣本時，發(fā)現(xiàn)它們在4×105菌落形成單位時沒有交叉反應(yīng)或干擾cobas?EGFR測試。

05

總結(jié)

如上述交叉反應(yīng)的定義，是一個被觀察的試劑的反應(yīng)，它引起的反應(yīng)超出預(yù)期的主要反應(yīng)。一個試劑盒的分析特異性不能以是否有交叉反應(yīng)而評價，而是要看超出預(yù)期的反應(yīng)的類型。

如果是與非靶標(biāo)分析物反應(yīng)出檢測范圍內(nèi)的分析物，則說明試劑盒有非特異性存在，即產(chǎn)生了假陽性結(jié)果；

但如果反應(yīng)出檢測范圍外的分析物同時也未影響試劑盒的檢出率和分析特異性那這個交叉反應(yīng)個人覺得是允許的。