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眾所周知，在實(shí)時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）中模板的濃度對數(shù)值與結(jié)果Ct值呈線性關(guān)系，Ct值越小，濃度越高。根據(jù)所選取定量數(shù)學(xué)模型的差別，主要有外標(biāo)定量法（外標(biāo)法）和內(nèi)標(biāo)定量法（內(nèi)標(biāo)法）兩種定量方法。這些數(shù)學(xué)模型就像特殊標(biāo)記的尺子，把得到的Ct值測量為濃度值。

外標(biāo)法：即絕對定量，是使用一系列稀釋的已知濃度標(biāo)準(zhǔn)品與臨床標(biāo)本同時進(jìn)行測定，求出標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值與起始模板濃度之間的線性比例關(guān)系。通過待測標(biāo)本的Ct值就可以在線性關(guān)系中求出其原始的模板濃度。

內(nèi)標(biāo)法：是指將標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)標(biāo)與待測樣本在同一管內(nèi)擴(kuò)增，然后通過內(nèi)標(biāo)的量來推導(dǎo)待測模板的量，是一種相對定量的數(shù)學(xué)模型。該模型是假定了臨床樣本和內(nèi)標(biāo)有一致的擴(kuò)增效率。[1]

QA&

內(nèi)標(biāo)法需要檢測標(biāo)準(zhǔn)品嗎？

需要。要實(shí)現(xiàn)對樣本的定量檢測，必然需要使用到已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，就像天平稱量離不開砝碼一樣。內(nèi)標(biāo)法就像是用了一個蘋果充當(dāng)砝碼，但這個蘋果最初肯定得使用砝碼稱量一遍。

與外標(biāo)法直接比較待測樣本和標(biāo)準(zhǔn)品不一樣，內(nèi)標(biāo)法使用靶基因Ct值和內(nèi)標(biāo)Ct值的差值進(jìn)行運(yùn)算。多一個維度的參數(shù)，使得該方法更為準(zhǔn)確，但也使得運(yùn)算更為復(fù)雜。該差值與靶基因起始模板量之間呈二次函數(shù)關(guān)系，所以需要測定更多的標(biāo)準(zhǔn)品（6個以上）才能保證這個二次函數(shù)的準(zhǔn)確性。

因此，內(nèi)標(biāo)法不但需要檢測標(biāo)準(zhǔn)品，而且還需要檢測更多的標(biāo)準(zhǔn)品。

QA&

如何不帶標(biāo)準(zhǔn)品使用內(nèi)標(biāo)法？

不帶標(biāo)準(zhǔn)品的內(nèi)標(biāo)法=調(diào)用標(biāo)準(zhǔn)曲線的外標(biāo)法；由于成本的考慮，使用內(nèi)標(biāo)法的廠家大都未使用標(biāo)準(zhǔn)品。所以在檢測過程中，這些廠家便采用調(diào)取出廠標(biāo)準(zhǔn)曲線函數(shù)的方式。部分實(shí)驗(yàn)室在使用外標(biāo)法時也會用到這個方法，但這種方式往往是極不被推薦的。因?yàn)槿绻�不能排除不同儀器、不同批試劑、不同實(shí)驗(yàn)環(huán)境（溫度濕度）、不同實(shí)驗(yàn)操作等因素造成的影響，那么結(jié)果的準(zhǔn)確性就很難得到保證。

因而，無論是內(nèi)標(biāo)法還是外標(biāo)法，如希望不帶標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測，應(yīng)盡量避免上述風(fēng)險，所以只能選擇全封閉系統(tǒng)，并對使用環(huán)境做較為嚴(yán)苛的要求。

QA&

內(nèi)標(biāo)法可以徹底解決樣本間差異對定量結(jié)果的影響么？

不能。不同的標(biāo)本存在個體化差異，除靶序列的變異外，對PCR定量結(jié)果存在影響的還有多種因素。面對不同的干擾因素，兩種方法各有優(yōu)劣。

注：“-”沒有影響；“+”有一定影響；“++”有較大影響；

小結(jié)

內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法作為兩種不同的PCR定量方法模型，有各自的特點(diǎn)，并無本質(zhì)的優(yōu)劣勢之分。作為一項檢測技術(shù)，以提供科學(xué)、客觀、準(zhǔn)確的檢測結(jié)果為目的，為臨床醫(yī)生診斷和治療提供參考價值，充分體現(xiàn)檢測的臨床意義才是最重要的。