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一、 PCR實驗室規(guī)劃設計
如何建一個標準的PCR 實驗室？PCR實驗室如何設計規(guī)劃才堪稱專業(yè)？PCR實驗室管理又有哪些注意要點？
標準的PCR 實驗室分為四個區(qū)域，分別為：
n1.試劑配制區(qū)；
n2.樣品處理區(qū)；
n3.核酸擴增區(qū)；
n4.產物分析區(qū)；
如使用全自動分析儀，區(qū)域可適當合并。（進入各工作區(qū)域必須嚴格按照單一方向進行，不同的工作區(qū)域使用不同的工作服，例如不同的顏色。工作人員離開各工作區(qū)域時，不得將工作服帶出）
PCR實驗室平面布局
【各區(qū)的功能分別為】
試劑準備區(qū)：擴增試劑的配制、分裝和保存。
樣品處理區(qū)：樣品登記、分裝；核酸提取、保存和加樣。
擴增產物分析區(qū)：擴增產物的測定、結果分析、登記及報告。
擴增前區(qū)與擴增后區(qū)應嚴格分開，須使用不同的房間，兩區(qū)之間最好有一定的間隔。
使用商品化試劑盒可在樣品處理區(qū)進行少量試劑配制。
在滿足下列操作和清潔處理要求的前提下樣品處理區(qū)和試劑準備區(qū)可設在同一房間內：
在生物安全柜內操作；
每個實驗人員、實驗組分別使用各自的試劑及耗材；
盛放污染材料的器皿密封并一次性使用；
用有效的方法對操作區(qū)域和共享器具在實驗前后進行清潔及消毒。
PCR實驗室建設規(guī)劃要點
1、主體結構：
主體為彩鋼板、鋁合金型材。室內所有陰角、陽角均采用鋁合金50內圓角鋁，從而解決容易污染、積塵、不易清掃等問題。結構牢固，線條簡明，美觀大方，密封性好。
2、標準的三區(qū)分隔和氣壓調節(jié)：
將PCR過程分成試劑準備、標本制備和PCR擴增檢測三個獨立的實驗區(qū)。整個區(qū)域有一個整體緩沖走廊。每個獨立實驗區(qū)設置有緩沖區(qū)， 同時各區(qū)通過氣壓調節(jié)，使整個PCR實驗過程中試劑和標本免受氣溶膠的污染并降低擴增產物對人員和環(huán)境的污染。
可打開緩沖區(qū)Ⅰ，緩沖區(qū)Ⅱ和 PCR 擴增區(qū)的排風扇往外排氣，在實驗區(qū)的外墻上和各扇門上都安裝有風量可調的回風口，空氣通過回風口向室內換氣。
3、 消毒：
在三個實驗區(qū)和三個緩沖區(qū)頂部以及傳送窗內部安裝有紫外燈，供消毒用。
在試劑準備區(qū)和標本制備區(qū) 還設置移動紫外線燈，對實驗桌進行局部消毒。
4、機械連鎖不銹鋼傳遞窗：
試劑和標本通過機械連鎖不銹鋼（不建議使用電子連鎖方式）傳遞窗傳遞，保證試劑和標本在傳遞過程中不受污染（人物分流）
5、 地面
地面建議使用PVC卷材地面或自流坪地面，整體性好。便于進行清掃，耐腐蝕。沒有條件的也可采用水磨石地面，或大塊的瓷磚（至少800mm×800mm）接縫需要小于2mm。
6、照明
燈具要選用凈化燈具，能達到便于清洗、不積塵的特點。
在建設的過程中應注意
●規(guī)范的安裝流程和全面的服務流程。
●嚴格按照規(guī)范科學設計的安裝流程。
●安裝前需要確定以下安裝條件，如：電源電壓，電源進線位置，電話網絡線進線位置，進水水壓，最小安裝空間，地面平整度，通風孔、進水管和下水管的位置等，理想狀態(tài)的空間尺寸和通風口尺寸。
設計要點
PCR實驗室可以是分散形式，也可以是組合形式。完成一組PCR實驗，通常應經過試劑配制、樣品處理、核酸擴增及產物分析四個實驗過程，若實驗工藝需要，還應增加樣品粉碎過程。
一、分散形式PCR實驗室
所謂分散形式PCR實驗室，是指完成上述實驗過程的實驗用房彼此相距較遠，呈分散布置形式。對于這種布置形式的PCR實驗室，由于各個實驗之間不易相互干擾，因此無需特殊條件要求。
二、組合形式PCR實驗室
所謂組合形式PCR實驗室, 是指完成PCR四個實驗過程的實驗用房相鄰布置，組成獨立實驗區(qū)域的形式。對于組合形式PCR實驗室，由于各個實驗間集中布置，容易造成相互干擾，因此，對總體布局以及屏障系統(tǒng)具有一定的要求。各室在入口處設緩沖間，以減少室內外空氣交換。
一些經驗：
試劑配制室及樣品處理室宜呈微正壓，以防外界含核酸氣溶膠的空氣進入，造成污染；
可以通過控制進風風量大于排風風量達到正壓效果。
核酸擴增室及產物分析室應呈微負壓，以防含核酸的氣溶膠擴散出去污染試劑與樣品，可以通過控制排風風量大于進風風量達到負壓效果。
在理想情況下，PCR實驗室緩沖間內，可設置正壓，使室內空氣不流向室外，室外空氣不流向室內。PCR實驗室進風由原有中央空調控制，要求將中央空調風口安裝到指定定點，且高度為地面鋪裝好后2600mm處。
如果使用熒光PCR儀，擴增室和產物分析室可以合并。
若房間進深允許，可設PCR內部專用走廊。需要指出的是在減少室內外空氣交換方面，緩沖間比專用走廊更有意義。
各個區(qū)域之間應具備單向的實驗工藝流、物流、人流與氣流，形成單向流程的保護屏障，避免實驗之間的相互干擾，防止核酸氣溶膠對實驗過程造成污染產生假性結果。
實驗室的墻體，包括頂棚，應結構牢固、氣密性好；所有陰角宜采用圓弧形線條過渡；墻體內壁光潔、不吸附、耐腐蝕、易清洗消毒；地面材料應滿足無縫隙、無滲漏、光潔、耐腐蝕的要求。
PCR實驗室主要設備
試劑準備區(qū)
儀器設備主要有冰箱、超凈臺、加樣器、混勻器、天平和離心機等，加樣器、天平除了要專用外，還應有定期校準。試劑分裝應在超凈臺中進行 擴增反應混合液應使用分子生物學級的，試劑制備好后應有質檢：一是否有污染、二是檢測試劑的擴增效果。
標本制備區(qū)
儀器設備主要有生物安全柜、加樣器、離心機、溫育儀、混勻器等
擴增區(qū)
擴增區(qū)的主要儀器是核酸擴增儀、超凈臺、微量加樣器、離心機、可移動紫外燈。擴增儀需進行校準。并配備UPS電源，以防止由于電壓的波動，停電對擴增效果的影響。
分析區(qū)
本區(qū)所使用的儀器設備有酶標儀、洗板機、加樣器和水浴箱等 潔凈實驗區(qū)的緩沖間部分面積不能超過主實驗室的八分之一,這是有規(guī)定的。
一些瑣碎的、不可忽略的設計
1.實驗室空調通風系統(tǒng)設計及壓力控制
PCR實驗室并沒有嚴格的凈化要求，但是為避免各個實驗區(qū)域間交叉污染的可能性，宜采用全送全排的氣流組織形式。同時，要嚴格控制送、排風的比例以保證各實驗區(qū)的壓力要求。
2.污染的預防與控制
PCR實驗室設計的核心問題是如何避免污染。在實際工作中，常見的有以下幾種污染類型：擴增產物的污染；天然基因組DNA的污染；試劑的污染以及標本間的污染。由于一旦發(fā)生污染，實驗就必須停止，直到找到污染源為止，而且實驗結果必須作廢，需重新進行實驗。所以發(fā)生污染后再圍繞實驗室來尋找污染源不但耗時而且繁瑣，浪費人力物力。因此要避免污染，首先應是預防，而不是排除。
PCR實驗室不可缺少的嚴格管理
（1）嚴格控制進出實驗室的人員。與實驗無關的人員不得隨意進出實驗室，有條件的情況下要設置獨立的通道和進出整個實驗區(qū)的門；
（2）盡量減少在實驗區(qū)內不必要的走動以減少交叉污染的可能性。
（3）擴增產物分析區(qū)是最主要的擴增產物污染來源，廢液不能在實驗室中傾倒，必須經消毒液浸泡消毒后在遠離實驗室的地方棄掉，用過的吸頭等一次性材料也應經消毒液浸泡消毒后統(tǒng)一處理，如焚燒等；
（4）擴增產物分析區(qū)可能會用到某些可致基因突變和有毒物質，應特別注意實驗人員的安全防護。3.5完備的實驗室配套設施 完備的實驗室配套設施是保證實驗工作的必要條件，應根據(jù)各個實驗室實驗內容的不同配備相應的設備和儀器，如超凈工作臺、離心機、加樣器等。
二、 PCR實驗室防污染措施及應急處理方法
污染，是PCR實驗室出現(xiàn)實驗假陽性、結果不可信、研發(fā)不可靠的重要推手，PCR實驗室應當將防污染作為日常管理、實驗安排、清潔消毒、實驗習慣的核心。PCR 實驗污染和細胞污染是有差別的，PCR 實驗污染主要是核酸而不是細菌和其他入侵者。因此所有的預防措施都會稍稍有所不同�！耙撞椴灰撞臁保廴緛淼那臒o聲息，我們該如何應對。今天給大家簡單介紹一下PCR實驗室的主要污染來源、實驗中如何避免和減少污染的可能性及實驗發(fā)生污染的應急處理方案。
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PCR實驗室的污染來源
1、樣本間交叉污染：
收集樣本的容器被污染或樣本密封不嚴外溢；不同樣本移液時忘記更換槍尖或未使用帶濾芯槍尖；移液器等實驗器具及耗材未及時消毒滅菌；不同樣本同時開蓋或樣本劇烈震蕩、反復吹吸導致氣溶膠形成擴散，相互交叉污染。
2、實驗試劑污染：
主要是在 PCR 組分試劑加樣過程中，由于移液器、容器、陰性對照及其它試劑被核酸模板或陽性對照污染。 加樣過程中，因為 PCR 試劑對溫度十分敏感，需要通過冰浴使得 PCR 試劑和 PCR 板/管處于 0℃，但這個過程也是充滿了污染的風險的。
3、擴增產物污染：
大量拷貝的產物泄漏或擴增后的PCR反應管意外開蓋，這是 PCR 反應中最主要最常見的污染問題。因為 PCR 產物拷貝量大，遠遠高于 PCR 檢測數(shù)個拷貝的極限，所以極微量的 PCR 產物污染，就可形成假陽性。
4、克隆質粒污染：
作為陽性質控品的克隆質粒外溢。
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PCR實驗室的防污染方法
按照實驗室的安全工作制度或安全標準操作程序，所有操作符合《實驗室生物安全通用要求》（GB19489-2008）。
1、嚴格執(zhí)行各區(qū)功能劃分：
試劑儲存和準備區(qū)：貯存試劑的制備、試劑的分裝和擴增反應混合液的準備，以及離心管、吸頭等消耗品的貯存和準備。
標本制備區(qū)：核酸（RNA、DNA）提取、貯存及其加入至擴增反應管。對于涉及臨床樣本的操作，應符合生物安全二級實驗室防護設備、個人防護和操作規(guī)范的要求。
擴增區(qū)：cDNA合成、DNA擴增及檢測。
擴增產物分析區(qū)：擴增片段的進一步分析測定，如雜交、酶切電泳、變性高效液相分析、測序等。
試劑準備區(qū)、樣本制備區(qū)和擴增區(qū)內的實驗用品，包括移液器等器具應專用，空氣、物品流向依次為：試劑準備區(qū)、樣本制備區(qū)、擴增區(qū)、產物分析區(qū)，不可逆行。
2、清潔的實驗用品：
實驗室自配試劑（去離子水、緩沖液等）和所有使用器具在使用之前均應高壓滅菌或紫外殺菌。槍尖、反應管等實驗耗材應一次性使用。
3、正確的實驗操作：
實驗應在超凈工作臺內進行，工作臺內應放置PCR專用的微量離心機、各量程的移液器和其他必須物品。
實驗的過程中選擇最合適尺寸的手套并能及時更換，在進出不同實驗區(qū)域或進行模板操作后都應更換實驗服、口罩、帽子及手套，以避免不同實驗區(qū)交叉污染。
裝有PCR試劑的反應管在打開之前應先瞬時離心，將管壁及管蓋上的液體離至管底，降低污染手套或加樣器的風險；謹慎開啟反應管，防止管內液體濺出或形成氣溶膠導致污染。
吸加試劑和模板的操作應嚴格按照規(guī)范要求進行，遵守“慢吸快打”原則，盡量一次性完成，忌多次抽吸，以避免氣溶膠產生的交叉污染。
PCR試劑建議小量分裝，以減少反復凍融、重復取樣次數(shù)；多樣本PCR反應時，先配制反應混合液分裝至反應管中，最后加入樣本核酸，請勿同時開蓋，盡量保證單人單管，實現(xiàn)完全閉管操作。
實驗試劑應與樣品和PCR產物分開保存，不應放于同處。
PCR擴增實驗完成后及時將反應管取出，用一次性手套將產物反應管包裹丟棄，保證管蓋緊閉。
4、規(guī)范的實驗設計：
應遵循實驗室內部質量控制的相關規(guī)定，實驗中設立陽性對照、陰性對照和空白對照，全程質控實驗過程，驗證PCR反應的可靠性，并協(xié)助判斷擴增系統(tǒng)的可信性。
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PCR實驗室的污染應急處理方法
1、若核酸樣本溢出：
立即用布或紙巾覆蓋，由外圍向中心傾倒10%的次氯酸消毒劑，約30分鐘后，清除污染物品，再用次氯酸消毒劑擦拭，并用75%酒精噴灑，移動紫外車定點照射1小時。
2、其他不明情況污染：
1、暫停所有實驗操作；2、清理實驗室內所有物品，尋找污染來源；3、加大實驗室的通風；4、對實驗室內所有表面（臺面、地面及墻面） 進行消毒；5、75%酒精空中噴霧；6、開啟紫外消毒裝置，延長紫外照射時間（4小時以上）；7、以上措施每日進行，直至污染消除；用新試劑及確認無污染的器材進行原污染項目的試劑空白檢測，連續(xù)3次均陰性后方可進行常規(guī)檢測。
PCR污染的范圍很廣，不同樓層也會產生影響，甚至會影響相鄰建筑；PCR污染的時間很長，幾個月甚至半年；PCR污染的影響很深，影響我們的生產計劃，阻礙我們的研發(fā)進度，直接造成公司人力、財力的損失。但隨著新技術和一些問題的明晰，無污染PCR檢測的那一天離我們會越來越近！
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