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2019新型冠狀病毒于2020年1月12日被世界衛(wèi)生組織（WHO）命名為2019-nCoV。2020年3月13日，世衛(wèi)組織將2019冠狀病毒疫情從流行病升級為全球大流行病，疫情已在全球廣泛傳播。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分子診斷方法成為病原體檢測的一項(xiàng)革命性技術(shù)。我國在此次疫情爆發(fā)之初，就將核酸檢測產(chǎn)品及時應(yīng)用到了疫情防控之中，是新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)病例確診的金標(biāo)準(zhǔn)。然而隨著核酸檢測方法的廣泛應(yīng)用，不斷出現(xiàn)的核酸檢測假陰性率較高的質(zhì)疑也成為媒體關(guān)注熱點(diǎn)。臨床學(xué)者從標(biāo)本采集、檢測方法、產(chǎn)品穩(wěn)定性等多方面剖析產(chǎn)生假陰性的可能原因[1]。隨著科研人員對新冠病毒基因組的解析，我們對新冠RT-PCR核酸檢測試劑的檢測性能與其基因組結(jié)果特征之間的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行了解析。

2019-nCoV為單股正鏈RNA病毒，基因組長29.8kb，病毒基因組全長的三分之二是開放性讀碼框（ORF）。2019-nCoV主要由結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白組成，結(jié)構(gòu)蛋白包括E基因編碼的包膜蛋白、M基因編碼的膜蛋白、N基因編碼的核衣殼蛋白、S基因編碼的刺突樣糖蛋白[2]。

國家藥監(jiān)局應(yīng)急批準(zhǔn)的30個新型冠狀病毒檢測產(chǎn)品中核酸檢測試劑19個。

國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心《新型冠狀病毒核酸檢測室間質(zhì)量評價結(jié)果報告》顯示，當(dāng)前應(yīng)用最廣泛的核酸檢測方法是熒光定量PCR法，而獲批的實(shí)時熒光定量PCR法試劑盒檢測靶標(biāo)主要針對新冠病毒基因組開放性讀碼框ORF1ab、N基因、E基因保守區(qū)域進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。

１、病毒突變對檢測試劑性能的可能影響

前期的研究結(jié)果顯示新冠病毒傳播過程中發(fā)生了大量廣泛的單核苷酸變異，在最新的李蘭娟[3]院士團(tuán)隊(duì)的研究結(jié)果表明，在對收治的11名新冠病毒感染患者體內(nèi)分離到的新冠病毒進(jìn)行了病毒突變情況分析后，統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)有7株在ORF1ab區(qū)域產(chǎn)生12個突變，有2株在N基因區(qū)域產(chǎn)生3個突變。核酸檢測試劑的引物設(shè)計(jì)雖通常位于病毒基因組序列的保守區(qū)，但經(jīng)過分析比對發(fā)現(xiàn)已知的這些突變不在現(xiàn)有試劑引物相應(yīng)位置及核酸檢測靶標(biāo)部位。越來越多的病毒基因組變異情況得到證實(shí)，那么在進(jìn)化保守區(qū)域是否存在在進(jìn)化上的保守區(qū)域的突變還未可知，若突變位置發(fā)生在病毒 RNA的引物設(shè)計(jì)區(qū)域，則可能直接導(dǎo)致檢測結(jié)果的假陰性。

另一方面，病毒突變也可能對抗體檢測產(chǎn)生影響。此項(xiàng)研究同時發(fā)現(xiàn)，分離到的11株病毒中在S基因區(qū)域有8個毒株產(chǎn)生10個突變，其中一個毒株在S基因區(qū)域的突變導(dǎo)致氨基酸發(fā)生了改變，而氨基酸變異可能導(dǎo)致其蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，且S蛋白是新冠病毒與宿主細(xì)胞表面受體結(jié)合的主要蛋白。由于結(jié)構(gòu)蛋白發(fā)生變異導(dǎo)致患者體內(nèi)產(chǎn)生針對突變S蛋白的抗體，那么就可能導(dǎo)致現(xiàn)在針對未突變S蛋白的抗體檢測試劑檢測不到感染者體內(nèi)產(chǎn)生的抗體而出現(xiàn)假陰性的情況。

２、新冠病毒轉(zhuǎn)錄機(jī)理對檢測試劑性能的可能影響

在對核酸檢測假陰性的分析中也多次提到病毒載量對檢測結(jié)果的影響。實(shí)時PCR，就是檢測PCR擴(kuò)增周期每個時間點(diǎn)上擴(kuò)增產(chǎn)物的量，是通過對擴(kuò)增反應(yīng)中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實(shí)時檢測，從而實(shí)現(xiàn)對起始模板（目的基因）的定量及定性分析。因此反應(yīng)中病毒載量對應(yīng)的目的基因含量將直接影響檢測結(jié)果，而檢測試劑的檢測限就是檢測試劑能檢測到的相應(yīng)反應(yīng)體系中的目的基因含量，如圣湘生物的新冠檢測試劑最低檢測限為200copies/ml，即可檢測出1ml反應(yīng)中的最低病毒載量為200copies的病毒。在2020年4月23日《細(xì)胞》（Cell）雜志上發(fā)表的對新冠病毒的轉(zhuǎn)錄組體系結(jié)構(gòu)的研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，新冠病毒正鏈RNA進(jìn)入宿主細(xì)胞后，一方面作為 mRNA指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄蛋白合成，另一方面通過自身編碼的RNA 依賴的 RNA 聚合酶作用生成負(fù)鏈RNA，再以其為模板生成正鏈基因組RNA完成復(fù)制，正鏈基因組RNA由結(jié)構(gòu)蛋白包裝后組裝子代完整病毒。新冠狀病毒的一個重要特點(diǎn)是其獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄策略，新冠病毒基因組RNA還以負(fù)鏈RNA為模板進(jìn)一步合成亞基因組RNA。新冠病毒轉(zhuǎn)錄體中含有大量亞基因組RNA[4]，ORF1ab基因由病毒全長基因組轉(zhuǎn)錄獲得，因此只存在于完整的病毒基因組，只能由病毒全長基因組轉(zhuǎn)錄獲得，而N基因同時存在于全長基因組和其他亞基因組RNA。那么，在新冠病毒轉(zhuǎn)錄過程中，其N基因轉(zhuǎn)錄合成量較ORF1ab更高。

對于此項(xiàng)新冠病毒的轉(zhuǎn)錄組結(jié)構(gòu)研究，早期也有很多實(shí)際驗(yàn)證支持，如韓國學(xué)者對于引物探針組的比較分析的一項(xiàng)研究中顯示：同樣的一個樣本，用中國、德國、香港、日本、泰國和美國官方推薦的引物探針進(jìn)行測評，發(fā)現(xiàn)N基因檢測結(jié)果ct值較其他基因的小3個左右。中國的N基因+ORF1ab的組合，對新冠病毒檢測是更為敏感可靠的實(shí)驗(yàn)室檢測方法[5]。

我國國家藥品監(jiān)督管理局（NMPA）獲批的新冠PCR檢測試劑中，以雙靶標(biāo)（ORF1ab與N基因）為主，如果單純檢測ORF1ab基因的試劑，對于無癥狀感染者或康復(fù)期類型的病毒載量較低患者，理論上患者體內(nèi)病毒轉(zhuǎn)錄合成ORF1ab基因含量較N基因更低，其檢測漏檢風(fēng)險更高，那么從《全國新型冠狀病毒核酸檢測室間質(zhì)量評價結(jié)果報告》中對低濃度的病毒檢出情況也可以印證這個推論。對于低濃度樣本（128 copies/mL）能檢出的NMPA試劑廠家為圣湘生物及達(dá)安基因，均為ORF1ab與N雙靶標(biāo)檢測試劑。

核酸檢測產(chǎn)品的即時研發(fā)和應(yīng)用，在COVID-19患者的確診和臨床治療過程中發(fā)揮了重要作用，而選擇靈敏度高、特異性好、可重復(fù)性好的核酸擴(kuò)增試劑是獲得準(zhǔn)確檢測結(jié)果的基礎(chǔ)，因此對核酸檢測產(chǎn)品的性能及影響因素的關(guān)注是非常重要的[6]。

觀點(diǎn)小結(jié)：

1. 新冠病毒在傳播過程中發(fā)生了大量廣泛的變異，現(xiàn)階段尚未涉及影響到核酸檢測試劑的檢測性能，但發(fā)生在檢測目的基因ORF1ab區(qū)域及N基因的突變需持續(xù)關(guān)注；

2. S基因的突變可能導(dǎo)致蛋白構(gòu)象及免疫原性發(fā)生改變，對于抗體檢測試劑帶來的影響不容忽視；

3. ORF1ab基因僅存在與于全基因組轉(zhuǎn)錄過程中，僅針對ORF1ab基因的單靶標(biāo)核酸檢測試劑對低病毒載量樣本以及病毒突變株易造成漏檢，同時檢測N基因及ORF1ab基因的雙檢測靶標(biāo)產(chǎn)品能更好的避免檢測試劑以上因素導(dǎo)致漏檢情況的發(fā)生。