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核酸檢測(cè)是目前新冠肺炎確診的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但核酸檢測(cè)也有很大的局限性，例如當(dāng)前普遍應(yīng)用的鼻咽拭子采樣有時(shí)難以采集到病毒，再加上試劑本身的敏感度問題，核酸檢測(cè)可能會(huì)出現(xiàn)漏檢�？贵w檢測(cè)作為新冠肺炎確診的重要輔助方式，可與核酸檢測(cè)互相補(bǔ)充驗(yàn)證以提高診斷的準(zhǔn)確率，也可用于篩查無癥狀或輕狀感染者，有助于國家對(duì)疫情整體形勢(shì)進(jìn)行判斷和追蹤。美國正準(zhǔn)備推動(dòng)全民新冠病毒抗體檢測(cè)行動(dòng)，篩選產(chǎn)生新冠病毒抗體的人，以便評(píng)估現(xiàn)有防疫措施的效果，并為精細(xì)化隔離及復(fù)工等決策提供參考。
目前國內(nèi)新冠疫情防控形勢(shì)逐漸好轉(zhuǎn)，但海外疫情仍在持續(xù)惡化，短期內(nèi)海外市場對(duì)抗體檢測(cè)試劑盒的需求激增，海外不斷拋來的訂單讓國內(nèi)具有出口資質(zhì)的試劑盒公司忙于擴(kuò)大產(chǎn)能，加班加點(diǎn)地趕工生產(chǎn)。近日，又有2家公司的新冠病毒抗體檢測(cè)試劑盒獲得國家藥監(jiān)局的批準(zhǔn)，搶到了進(jìn)軍海外市場的入場券。截止目前，國家藥監(jiān)局已應(yīng)急批準(zhǔn)9家企業(yè)共11個(gè)新冠抗體檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品（表1）。
表1 國家藥監(jiān)局批準(zhǔn)新冠病毒抗體檢測(cè)試劑盒清單
在國家藥監(jiān)局批準(zhǔn)的抗體檢測(cè)試劑盒中，有6種產(chǎn)品利用膠體金法，5種產(chǎn)品使用化學(xué)發(fā)光法。膠體金的優(yōu)勢(shì)是使用方便快速，成本低，應(yīng)用范圍廣，技術(shù)難度系數(shù)相對(duì)較低，但存在靈敏度低、無法定量等局限�；瘜W(xué)發(fā)光檢測(cè)的靈敏度高，不僅可顯著提高臨床檢測(cè)的準(zhǔn)確性，還具備高通量、簡便安全、速度快等特點(diǎn)。小編之前已介紹過膠體金法（文尾可查看前文），今天小編就帶大家了解下化學(xué)發(fā)光法是怎么一回事。
目前藥監(jiān)局批準(zhǔn)的化學(xué)發(fā)光試劑盒的檢測(cè)原理是將新冠病毒抗原蛋白包被在微粒上，抗原蛋白將結(jié)合新冠肺炎患者血清中的IgG/IgM，隨后加入化學(xué)標(biāo)記的人IgG/IgM二抗，經(jīng)過清洗去除游離態(tài)的化學(xué)標(biāo)記物后再加入發(fā)光底物產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，通過測(cè)量光信號(hào)完成對(duì)血清中IgG/IgM的定性或定量檢測(cè)（圖1）。
圖1 新冠化學(xué)發(fā)光抗體檢測(cè)試劑盒原理
那么目前用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)新冠病毒抗體的效果到底怎么樣呢？小編通過介紹一篇研究論文來帶領(lǐng)各位看官一探究竟。
2020年3月27日，廣東省組織器官區(qū)域免疫與疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的研究人員在預(yù)印本平臺(tái)bioRxiv上發(fā)表論文"Evaluations of serological test in the diagnosis of 2019 novel coronavirus (SARS-CoV-2) infections during the COVID-19 outbreak"，對(duì)應(yīng)用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行新冠病毒抗體檢測(cè)的靈敏度和特異性進(jìn)行了研究，文章內(nèi)容如下：
研究人員首先對(duì)化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行組裝。他們利用原核表達(dá)系統(tǒng)重組表達(dá)出新冠病毒的全長核衣殼蛋白（Nucleocapsid Protein, 以下簡稱N蛋白），將N蛋白與磁微粒進(jìn)行偶聯(lián)，用于捕獲血清中的特異性抗體。同時(shí)他們對(duì)抗人IgG、IgM的抗體進(jìn)行化學(xué)標(biāo)記，用于檢測(cè)血清中的IgG和IgM。
研究人員收集到79位新冠確診患者的血清作為實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)收集29位健康人員和51位結(jié)核病患者的血清作為對(duì)照組。利用化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的血清，研究人員發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組血清IgM檢測(cè)信號(hào)的平均強(qiáng)度為對(duì)照組的6-8倍，而IgG的平均信號(hào)強(qiáng)度則為對(duì)照組的60-70倍，說明IgG的檢測(cè)信號(hào)更強(qiáng)（圖2）。
圖2 對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組血清的IgM和IgG檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度
研究人員以IgG和IgM的平均信號(hào)強(qiáng)度為基準(zhǔn)線，發(fā)現(xiàn)在檢測(cè)血清中IgG時(shí)，實(shí)驗(yàn)組中有65例的檢測(cè)信號(hào)為陽性，對(duì)照組中有2例信號(hào)為陽性，說明IgG的檢測(cè)靈敏度和特異性分別為82.28% （65/79）和97.5%（2/80）；IgM的檢測(cè)靈敏度同樣為82.28%（65/79），但特異性僅為81.25%（15/80），明顯低于檢測(cè)IgG的97.5%（表2）。
表2 對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組血清IgM和IgG檢測(cè)的靈敏度和特異性
因?yàn)镮gG和IgM的檢測(cè)特異性差別較大，研究人員對(duì)兩種檢測(cè)方案與新冠確診患者的性別、年齡和發(fā)病天數(shù)的關(guān)系進(jìn)行了研究，他們發(fā)現(xiàn)確診患者的性別和發(fā)病天數(shù)對(duì)IgG和IgM的檢測(cè)結(jié)果無明顯影響，但發(fā)現(xiàn)18歲以下的確診患者其IgG和IgM的陽性檢出率明顯低于18歲以上的確診患者（表3、4）。
表3 新冠確診患者的發(fā)病天數(shù)對(duì)IgM和IgG檢測(cè)結(jié)果的影響
表4 新冠確診患者的年齡對(duì)IgM和IgG檢測(cè)結(jié)果的影響
研究人員從上述血清樣本中取出65例實(shí)驗(yàn)組樣本和64例對(duì)照組樣本，對(duì)化學(xué)發(fā)光法和國產(chǎn)商業(yè)化ELISA試劑盒的檢測(cè)效果進(jìn)行了比較。兩種方法的IgM檢測(cè)假陽性率都為21%，而IgG檢測(cè)假陽性率則較低；化學(xué)發(fā)光法的IgM和IgG檢測(cè)的靈敏度都明顯高于ELISA試劑盒，說明化學(xué)發(fā)光法的實(shí)際檢測(cè)效果更好（表 5）。
表5 化學(xué)發(fā)光法與ELISA試劑盒用于檢測(cè)新冠病毒抗體的效果比較
文章結(jié)論：在新冠病毒抗體檢測(cè)中，化學(xué)發(fā)光法的實(shí)際檢測(cè)效果好于ELISA試劑盒，并且使用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)IgG的靈敏度和特異性都較高，可用于臨床輔助診斷新冠肺炎。
由于這篇論文的臨床樣本數(shù)量較小，論文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和結(jié)論還有待于更大規(guī)模樣本研究的確認(rèn)。此外因?yàn)樾鹿谝咔槿f分緊急，很多商業(yè)化的新冠抗體檢測(cè)試劑盒還未進(jìn)行嚴(yán)格的臨床實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證檢測(cè)效果，且試劑盒生產(chǎn)廠商為了趕進(jìn)度，產(chǎn)品的質(zhì)量和批間差也難以保障，因此這篇論文中化學(xué)發(fā)光法和ELISA試劑盒的檢測(cè)效果差異也需要更全面的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)來驗(yàn)證。
N蛋白是新冠病毒中重要的結(jié)構(gòu)蛋白，常作為新型冠狀病毒抗體檢測(cè)的抗原工具。這篇論文中的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒使用的抗原蛋白即為N蛋白，保證了此試劑盒具有較好的靈敏度和特異性。據(jù)小編所知，目前市場上的商業(yè)化新冠抗體檢測(cè)試劑盒（膠體金法和化學(xué)發(fā)光法）中，大多數(shù)使用的抗原蛋白也都是N蛋白。由此可見，N蛋白是新冠抗體檢測(cè)試劑的核心原料，其重組表達(dá)的純度和活性對(duì)檢測(cè)試劑的實(shí)際使用效果具有重要影響。
ACROBiosystems開發(fā)了His標(biāo)簽以及生物素標(biāo)記的新冠病毒N蛋白，并驗(yàn)證了N蛋白與Anti-N蛋白抗體的結(jié)合活性，靈敏度能達(dá)到0.02 ng/mL，可用于不同類型試劑盒的開發(fā)中。
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不同類型N蛋白的活性驗(yàn)證
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SARS-CoV-2 (COVID-19) Nucleocapsid protein, His Tag (C-terminus）
貨號(hào)：NUN-C5227
N蛋白與Anti-N蛋白抗體的結(jié)合靈敏度為活性驗(yàn)證0.02 ng/mL
Immobilized SARS-CoV-2 Nucleocapsid protein, His Tag (Cat. No. NUN-C5227) at 2 μg/mL (100 μL/well) can bind SARS-CoV-2 NP Antibody, Rabbit MAb (CLN27) with a linear range of 0.02-0.6 ng/mL.
SARS-CoV-2 (COVID-19) Nucleocapsid protein, His Tag (N-terminus）
貨號(hào)：NUN-C51H9
N蛋白與Anti-N蛋白抗體的結(jié)合靈敏度為活性驗(yàn)證0.02 ng/mL
Immobilized SARS-CoV-2 Nucleocapsid protein, His Tag (Cat. No. NUN-C51H9) at 2 μg/mL (100 μL/well) can bind SARS-CoV-2 NP Antibody, Rabbit MAb (CLN27) with a linear range of 0.02-0.3 ng/mL.
Biotinylated SARS-CoV-2 (COVID-19) Nucleocapsid protein, His,Avitag?
貨號(hào)：NUN-C81Q6
生物素標(biāo)記N蛋白與Anti-N蛋白抗體的結(jié)合靈敏度為活性驗(yàn)證0.4 ng/mL
Immobilized SARS-CoV-2 NP Antibody, Rabbit MAb (CLN27) at 2 μg/mL (100 μL/well) can bind Biotinylated SARS-CoV-2 Nucleocapsid protein, His,Avitag (Cat. No. NUN-C81Q6) with a linear range of 0.4-3 ng/mL.
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N蛋白產(chǎn)品列表
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貨號(hào) 種屬 產(chǎn)品名稱
NUN-C51H9 SARS-CoV-2 SARS-CoV-2 (COVID-19) Nucleocapsid protein, His Tag
NUN-C5227 SARS-CoV-2 SARS-CoV-2 (COVID-19) Nucleocapsid protein, His Tag
NUN-C81Q6 SARS-CoV-2 Biotinylated SARS-CoV-2 (COVID-19) Nucleocapsid protein, His,Avitag?
NUN-M51H5 MERS MERS Nucleocapsid protein, His Tag
NUN-S5148 SARS SARS Nucleocapsid protein, His Tag
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