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新型冠狀病毒疫情爆發(fā)以后，早期診斷成為控制疫情的關鍵，而熒光PCR技術成為首選的初篩檢測手段。目前核酸檢測率只有30-40%，使得檢測試劑盒的靈敏度備受關注。本期推薦林鏡中博士從引物探針設計的角度對試劑盒靈敏度的分析，以饗讀者。

一、前言

新型冠狀病毒疫情爆發(fā)以后，早期診斷成為控制疫情的關鍵，而熒光PCR技術成為首選的初篩檢測手段。到目前為止已經(jīng)有數(shù)家企業(yè)獲得了新型冠狀病毒熒光PCR檢測試劑的臨床注冊批文，還有近百家企業(yè)開發(fā)了類似的產(chǎn)品。近期有諸多聲音反映現(xiàn)有的新型冠狀病毒熒光PCR檢測試劑盒靈敏度較低，目前檢出率只有30-40%，多次出現(xiàn)漏檢的情況。業(yè)界對此進行了廣泛的討論，一個共識是造成檢出率低，假陰性率高有很多原因，包括試劑盒的靈敏度、試劑盒原材料的質量、核酸提取的效率、儀器設備的質量、操作誤差等，但是對試劑盒的靈敏度低的原因沒有系統(tǒng)的分析。筆者認為，引物探針設計是決定試劑靈敏度的關鍵，設計上存在的問題是內(nèi)在缺陷，很難通過優(yōu)化試劑盒組分和調整實驗條件來得到顯著改善。

早期診斷的靈敏度事關新型冠狀病毒疫情防控的成敗，同時今后將有一大批企業(yè)申報該產(chǎn)品的注冊批文，最終推向檢測市場，對人民健康產(chǎn)生深遠的影響。疫情爆發(fā)后，世界衛(wèi)生組織（WHO）發(fā)表了多個國家設計的新型冠狀病毒熒光PCR引物探針序列。筆者常年從事分子檢測試劑的研究開發(fā)，特別是熒光PCR技術。新型冠狀病毒疫情爆發(fā)后，我們也進行了相關產(chǎn)品的研發(fā)，我們發(fā)現(xiàn)WHO發(fā)布的來自不同國家的引物探針設計，有些存在比較明顯的缺陷。本文以美國CDC設計的N基因引物探針為例，論述Taqman熒光PCR引物和探針設計的基本原則，并提出一些建議，供同行們參考，避免走彎路，浪費資源，也算是為抗擊疫情盡一份力量。

任何技術都有優(yōu)缺點，站在不同的角度，側重點不一樣，或者使用的參數(shù)或算法或軟件不一樣，結論也可能各有所異。理論分析畢竟與臨床樣本檢驗的結果不可同日而語。產(chǎn)品的靈敏度最終都得經(jīng)過臨床試驗，達到注冊檢驗要求為標準。文中觀點難免偏頗，歡迎批評指正。

二、Taqman探針法熒光PCR的基本原理

實時熒光PCR是一種實時監(jiān)控特定核酸目標序列PCR擴增的技術。Taqman探針法是實時熒光PCR中應用最廣泛的技術。它的基本原理是在反應中加入一對特異的引物及一條經(jīng)熒光標記的Taqman探針，探針的5’端用報告熒光基團標記，3’端用淬滅熒光基團標記。在探針完整時，由于熒光共振能量轉移（FRET）的作用，報告基團的熒光被淬滅基團吸收發(fā)出不同于儀器收集波長的熒光，不能檢測到擴增信號，因此探針必須依賴Taq酶的5’-3’的外切活性，在引物結合到模板后隨著合成雙鏈的進程，將已經(jīng)與模板結合成雙鏈的探針切割，使報告熒光基團脫離淬滅基團的屏蔽而發(fā)出儀器應檢測的熒光信號。常用的報告基團包括HEX、FAM、ROX、JOE、VIC等，淬滅基團包括TAMRA、BHQ等。

三、Taqman探針法熒光PCR引物探針的設計

一些最基本的原則可以參考美國ABI（賽默飛）的PrimerExpress 3.0指南（表1）。

表1：Taqman熒光PCR探針和引物設計指南（PrimerExpress 3.0, ABI）

根據(jù)我們的經(jīng)驗，最重要的參數(shù)包括引物探針的位置、Tm值、發(fā)夾結構、二聚體。以下以WHO發(fā)表的美國CDC的N基因引物探針（表2）為例加以詳細論述。

表2： 美國CDC設計的引物探針序列

1、引物探針的位置

引物探針的設計原則中，最重要的是要避免假陰性（漏檢），同時保證特異性（避免假陽性），所以要選擇組內(nèi)（需要檢出的序列）保守（即盡量避開突變或采用簡并序列）、組間（對照序列）特異的區(qū)域。此外，為了獲得最佳的擴增效果，還應盡量滿足表1中的基本要求。

用SARS和蝙蝠CoV的N基因序列作為對照，對新型冠狀病毒的N基因序列排序，從圖1、2、3中可見，在美國CDC的設計中，除了第二套的上游引物不特異外，其余探針和引物的位置都是選擇了組內(nèi)保守組間特異的區(qū)域。第二套的探針和下游引物都是在特異的區(qū)域，所以也不會產(chǎn)生非特異的擴增。

圖1：美國CDC 2019-nCoV 第一套引物探針位置

圖2：美國CDC 2019-nCoV 第二套引物探針位置

圖3：美國CDC 2019-nCoV 第三套引物探針位置

第三套設計的探針N3P對2019-nCoV不特異（可同時結合到蝙蝠CoV）,5’端第二個位置設置為Y即T/C簡并，恰恰不能區(qū)分新型冠狀病毒、蝙蝠冠狀病毒和SARS病毒。但是上下游引物均為2019-nCoV特異，可能不會產(chǎn)生非特異性（假陽性）擴增。

2、Tm值

Taqman探針法熒光PCR通常采用二步法，即在94℃左右變性，60℃退火和延伸。所以，通常引物的Tm值設計在60±2℃，探針在70±2℃。

圖4: 美國第一套設計的Tm值

圖5：USCDC N基因第二套Tm值

圖6a: USCDC N基因第三套Tm值，探針5’端第二個序列為C

圖6b: USCDC N基因第三套Tm值，探針5’端第二個序列為T

從圖4、5、6中可見，這三套設計中的Tm值基本符合表1中的要求。第三套的探針N3P 5’端第二個序列設計為Y（T/C簡并），此處為C時（圖6a），探針N3P的Tm值略高，但通過優(yōu)化應該不會成為主要問題。

3、引物和探針的發(fā)夾結構

穩(wěn)定的二級結構（二聚體或發(fā)夾）降低引物探針利用效率的重要因素，特別是探針的發(fā)夾，容易造成探針利用率降低，從而使熒光信號偏低，影響檢測靈敏度。通常應控制發(fā)夾的dG≥-1.0 (注：dG是一個用于衡量裂解二聚體或發(fā)夾所需要能量的參數(shù)，二級結構越穩(wěn)定，裂解所需的能量越多，dG越小)。

采用DNA Star軟件對美國CDC設計的三套引物探針的發(fā)夾結構進行分析，結果（圖7）發(fā)現(xiàn)，第一套的下游引物N1R具有一個穩(wěn)定的發(fā)夾結構（dG=-2.3kc/m），第三套的探針N3P具有一個稍微穩(wěn)定的發(fā)夾結構（dG=-1.3kc/m），其余引物和探針均沒有穩(wěn)定的發(fā)夾。

圖7：USCDC引物和探針的發(fā)夾結構

 4、二聚體

設計時通常將二聚體（自身二聚體或配對二聚體）控制在dG>-5.0kc/m, 最好dG>-3.6 kc/m。從圖8顯示的三套引物探針的自身二聚體可見，第二套的探針具有一個非常穩(wěn)定的自身二聚體（dG=-13.1kc/m），第二套的上游引物N2F有一個穩(wěn)定的自身二聚體（dG=-9.3kc/m），第三套下游引物具有一個比較穩(wěn)定的自身二聚體（dG=-7.0kc/m）。

圖9顯示，美國CDC的第二套引物探針具有比較穩(wěn)定的配對二聚體（dG=-9.0kc/m）。圖10顯示第三套有兩個比較穩(wěn)定的配對二聚體（dG=-10.1kc/m）。

圖8：美國CDC基因引物和探針的自身二聚體

圖9：美國CDC第二套引物探針的配對二聚體

圖10：USCDC第三套引物探針配對二聚體

此外，當采用一管多檢（多重PCR）時，即一管同時檢測多個位點或多種病菌時，還要考慮不同位點之間的引物探針的配對二聚體。例如第一套和第二套組合時（圖11），第一套的正向引物和第二套的探針有一個相對穩(wěn)定的配對二聚體（dG=-8.3kc/m）。第一套和第三套組合時（圖12），第一套的探針和第三套的正向引物有一個穩(wěn)定的二聚體（dG=-12.2kc/m）。第二套和第三套組合時，第二套的上游引物和第三套的上、下游引物各有一個比較穩(wěn)定的二聚體（dG=-7.0kc/m圖13）。

圖11：美國CDC N基因第一套和第二套配對二聚體

圖12：美國CDC N基因第一套和第三套配對二聚體

圖13：美國CDC N基因第二套和第三套配對二聚體

綜上所述，美國CDC設計的三套引物探針，位置的選擇及Tm值的設計均比較合理，但是二級結構比較穩(wěn)定。第一套的反向引物N1R存在一個非常穩(wěn)定的發(fā)夾（dG=-2.3kc/m，圖7）。第二套探針的自身二聚體非常穩(wěn)定（dG=-13.1kc/m，圖8），上游引物自身二聚體也比較穩(wěn)定（dG=-9.3kc/m，，圖8），比較穩(wěn)定的配對二聚體比較多（dG=-6.8 ～ 9.0kc/m,圖9），引物和探針的利用效率會比較低。第三套探針N3P具有一個相對穩(wěn)定的發(fā)夾（dG=-1.3kc/m，圖7），探針和引物值均有相對穩(wěn)定的配對二聚體（圖10）。

四、結果的判斷

美國CDC提出對結果的判斷意見，認為只有當三個位點同時擴增曲線超過域值才能判斷為陽性（如圖11）。

筆者認為這種判別是沒有理論依據(jù)的。Taqman探針法熒光PCR除一對特異的引物以外還有一條特異的探針，基于設計的非特異性擴增的理論概率是非常小的。在新型冠狀病毒檢測中，以美國CDC的第一套引物探針為例，從圖1可見，上游引物處SARS病毒有一個3-bp的插入，是不可能擴增的，蝙蝠病毒在上游引物有4個突變，探針有1個突變，下游引物有5個突變，理論上由于錯配檢測出最接近的蝙蝠序列（假陽性）的概率為(1/4)10=9.5367x10-7。如果出現(xiàn)假陽性，最大可能性是交叉污染或氣溶膠污染。正確的判斷應該是，上述三個位點至少一個位點的擴增曲線超過了域值，即可判斷病例為陽性。目前市場上常見的熒光PCR檢測試劑大多數(shù)也只使用一個位點。

五、結論和建議

引物探針的設計原則中，最重要的是要避免假陰性（漏檢），同時保證特異性（避免假陽性），所以要選擇組內(nèi)（需要檢出的序列）保守（即盡量避開突變或采用簡并序列）、組間（對照序列）特異的區(qū)域，同時盡可能提高反應中引物和探針的利用效率。筆者認為參數(shù)的重要性依次是引物探針的位置、探針的發(fā)夾結構、探針對上游引物的相對位置、Tm值、引物發(fā)夾、二聚體。

筆者對WHO發(fā)表的來自七個國家設計的引物探針進行了詳細分析，發(fā)現(xiàn)均存在一定的缺陷，有些缺陷比較明顯，主要體現(xiàn)在：

1） 不特異（德國的E基因、香港大學Orf1b基因）；

2） 探針的發(fā)夾結構穩(wěn)定（中國CDC Orf1ab基因的探針、德國的SARS RdRP基因探針P1、香港大學N基因的探針）；

3） 引物和探針的相對位置不合理（中國CDC的N基因、德國的E基因、香港大學的Orf1b基因及E基因（設計在反鏈上）、日本的N基因）；

4） Tm值不合理（中國CDC的N基因及Orf1ab基因、德國的SARS RdRP基因及E基因、香港大學的Orf1b基因及N基因、日本的N基因、泰國的N基因）；

5） 引物的發(fā)夾結構穩(wěn)定（美國CDC N基因第一套的反向引物、香港大學Orf1b基因的正向及反向引物、香港大學N基因的正向引物）；

6） 引物探針的自身二聚體穩(wěn)定（中國CDC Orf1ab基因反向引物、美國CDC的N基因第二套的探針N2P、德國的E基因探針P1、香港大學的N基因正向引物及探針）；

7） 引物探針的配對二聚體穩(wěn)定（中國CDC的N基因、美國N基因第二和第三套、德國的E基因）。

筆者認為存在穩(wěn)定的發(fā)夾結構的探針基本不可以用。探針離上游引物太遠的擴增效率低，很難通過優(yōu)化來提高效率，應該盡可能避免。其他二級結構可能通過添加PCR促進劑或加入過量的組分（引物探針、Taq酶等）得到改善，Tm值不理想可以通過調整退火和延伸的溫度，但是象以上一些設計的引物和探針Tm值幾乎一樣，是不合理的，應該避免。

實際上，新型冠狀病毒的基因組與最接近的蝙蝠冠狀病毒的差異達到4%，與SARS病毒的差異達到20%，而目前的數(shù)據(jù)顯示武漢新型冠狀病毒內(nèi)部的差異非常小，約為十萬分之三（3.3x10-5），在基因組中或在N基因及Orf1ab基因中均有很多區(qū)域可以設計特異的、高效率的引物探針用于熒光PCR檢測試劑的開發(fā)應用。

磨刀不誤砍柴工，在科學技術面前沒有真正的捷徑可走。科學地設計引物探針是開發(fā)熒光PCR檢測試劑的基礎，是保證試劑盒靈敏度及特異性最基本的要素。為了避免走彎路，浪費資源，建議行業(yè)內(nèi)的廠家，嚴格按照熒光PCR技術引物探針設計的原則開發(fā)新型冠狀病毒熒光PCR檢測試劑。

作者簡介：林鏡中，加拿大多倫多大學博士，美國加州大學博士后。深圳市海外高層次B類人才�，F(xiàn)任深圳市賽格諾生物科技有限公司首席科學家/總經(jīng)理。曾任深圳市太太基因工程有限公司創(chuàng)始人/總經(jīng)理，美國Lynx醫(yī)藥公司高級研究員。