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在臨床病理診斷中，免疫組織化學(xué)(IHC)是一種很重要的技術(shù)和手段，從20世紀(jì)70年代開始，免疫組化技術(shù)就應(yīng)用于病理診斷，對于診斷腫瘤、腫瘤分類、判斷預(yù)后產(chǎn)生了巨大的影響，同時也擴展了人們對于各種疾病及腫瘤形成過程的認(rèn)識，提高了病理診斷與研究水平。但是，隨著免疫組化的廣泛應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)免疫組化技術(shù)存在一些局限性。深入研究免疫組化原理和技術(shù)，必須熟悉各種抗體真陽性反應(yīng)部位，實現(xiàn)實驗室間免疫組化標(biāo)準(zhǔn)化，使免疫組化在病理診斷中發(fā)揮最大的輔助作用。

在病理診斷中，隨著各種抗體新的用途不斷被發(fā)現(xiàn)及越來越多的新型抗體的出現(xiàn)，免疫組化在腫瘤診斷及鑒別診斷、分類、預(yù)后判斷等方面產(chǎn)生了重大的影響。由于免疫組化技術(shù)也存在一些局限性，因此，深入研究免疫組化原理和技術(shù)，并努力實現(xiàn)規(guī)范化的操作，才能充分發(fā)揮免疫組化在病理的診斷及鑒別診斷、判斷預(yù)后、指導(dǎo)臨床治療中的作用。

1、免疫組化技術(shù)

觀察組織切片中抗原的數(shù)量及其在組織中的分布情況，對抗原進(jìn)行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學(xué)，由于抗原與抗體特異性結(jié)合，因此通過免疫組化使標(biāo)記抗體的顯色劑(酶、熒光素、同位素、金屬離子等等)顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原(多肽和蛋白質(zhì))。IHC所用標(biāo)本主要為兩大類:組織標(biāo)本和細(xì)胞標(biāo)本，其中制作組織標(biāo)本最常用、最基本的方法是石蠟切片。石蠟切片對于組織形態(tài)保存好，有利于各種染色對照觀察，而且能長期保存;石蠟切片中使用的甲醛固定劑對組織內(nèi)抗原暴露有一定的影響，但可進(jìn)行抗原修復(fù)，是免疫組化中首選的組織標(biāo)本制作方法。

2、免疫組化技術(shù)在臨床診斷中的作用

目前免疫組化技術(shù)應(yīng)用于臨床主要有以下幾個方面

2.1腫瘤良惡性的判斷

對于反應(yīng)性增生還是腫瘤性增生，可用免疫球蛋白(Ig)的輕鏈抗體檢測B淋巴細(xì)胞增生的單克隆或多克隆性來區(qū)別。在濾泡反應(yīng)性增生時，濾泡反應(yīng)中心的細(xì)胞不表達(dá)細(xì)胞凋亡蛋白(bcl-2)，bcl-2陰性;而在濾泡性淋巴瘤中，由于90%以上腫瘤性濾泡細(xì)胞有bcl-2的高表達(dá)，bcl-2陽性。而增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)，周期素(Cycling)，核抗原(Ki-67)通過對腫瘤細(xì)胞增生的程度作出評價，從而提示增生細(xì)胞的良惡性。

2.2 確定腫瘤分期

腫瘤分期是判斷預(yù)后的一個指標(biāo)，與是否浸潤、有無淋巴管或血管侵襲密切相關(guān)，而通過免疫組化方法可以判斷腫瘤是否浸潤、有無淋巴管或血管侵襲。層黏連蛋白和Ⅳ型膠原的單克隆抗體可以清楚的顯示基膜的主要成分，用于區(qū)分原位癌和浸潤癌，一旦上皮性癌突破基膜為浸潤癌，未突破基膜為原位癌;顯示血管和淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)記物第八因子相關(guān)蛋白、D2-40等則可清楚顯示腫瘤對血管或淋巴管的浸潤。因此對許多腫瘤的良惡性鑒別及有無血管或淋巴管浸潤，免疫組化結(jié)果作為主要的鑒別依據(jù)。

2.3 細(xì)胞屬性的判定

通過特定抗體標(biāo)記出細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的抗原成分，來判定細(xì)胞的屬性，確定腫瘤的來源。如細(xì)胞角蛋白(CK)是上皮性標(biāo)記，CK陽性提示腫瘤為上皮源性腫瘤;降鈣素抗體是甲狀腺髓樣癌特有的標(biāo)記;甲狀腺球蛋白(Tg)陽性提示是甲狀腺濾泡性癌;前列腺特異性抗原(PAS)僅見于前列腺上皮;膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)陽性則提示膠質(zhì)腫瘤;CD20和CD79a陽性則提示B細(xì)胞淋巴瘤;平滑肌肌動蛋白(Actin)陽性提示腫瘤為平滑肌源性;胃腸道間質(zhì)瘤中原癌基因蛋白產(chǎn)物CD117陽性;血管源性腫瘤中內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物CD34陽性等等。

2.4確定來源不明的轉(zhuǎn)移瘤的原發(fā)部位

對于來源不明的轉(zhuǎn)移瘤，用免疫組化技術(shù)有助于確定惡性腫瘤的組織學(xué)來源，進(jìn)一步確定原發(fā)部位。如角蛋白抗體(CK20)在胃腸道癌、膽管癌、胰腺癌中陽性，而在肺癌、乳腺癌、腎癌中陰性;Tg陽性可考慮甲狀腺轉(zhuǎn)移;波形蛋白(Vimentin)陽性支持肉瘤的診斷;前列腺特異性抗原(PAS)陽性可考慮前列腺轉(zhuǎn)移;甲狀腺球蛋白陽性可考慮甲狀腺濾泡細(xì)胞癌;肌動蛋白(Actin)、肌球蛋白(Myosin)、結(jié)蛋白(Desmin)、肌紅蛋白(Myoglobin)陽性可考慮橫紋肌肉瘤;S-100蛋白陽性支持黑色素瘤的診斷;等等這些都為腫瘤的治療及預(yù)后提供了依據(jù)。

2.5對“未分化”惡性腫瘤的分類

未分化惡性腫瘤包括癌或肉瘤，在HE切片上由于腫瘤的“未分化”而缺少腫瘤細(xì)胞的起源特征不能分類，初步區(qū)分組織學(xué)類型用非特異性抗體，在其基礎(chǔ)上再選用特異性抗體做進(jìn)一步鑒定。如分化差的癌可顯示Vimentin或S-100蛋白，有時淋巴瘤可以表達(dá)上皮膜抗原，一些黑色素瘤表現(xiàn)出角蛋白，這同時也強調(diào)了在腫瘤診斷中應(yīng)使用一組抗體而不是單個抗體。

2.6進(jìn)一步分類不同器官與組織交界處腫瘤

由于重疊的特征，在一些組織器官交界處的腫瘤，僅憑組織學(xué)基礎(chǔ)對腫瘤進(jìn)行分類很困難。如胃腸道梭形細(xì)胞肉瘤是肌肉起源的平滑肌肉瘤，是間質(zhì)起源的胃腸道間質(zhì)瘤(GIST)，還是神經(jīng)起源的神經(jīng)鞘瘤;同樣發(fā)生于組織交界處的腫瘤有睪丸胚胎癌與精原細(xì)胞癌，兩者較難區(qū)別，且治療與預(yù)后顯著不同，但用免疫組化檢測角蛋白就較易于區(qū)別:角蛋白陰性則為精原細(xì)胞癌，而角蛋白陽性則為胚胎癌。

2.7及時準(zhǔn)確的發(fā)現(xiàn)微小轉(zhuǎn)移灶

采用常規(guī)病理方法難以檢出的實體瘤轉(zhuǎn)移稱為微小轉(zhuǎn)移灶。在常規(guī)組織切片中，辨別單個或幾個轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞很難，淋巴結(jié)內(nèi)竇性組織細(xì)胞增生與某些癌的早期轉(zhuǎn)移有時也不易區(qū)別，而采用免疫組化方法，有助于及時準(zhǔn)確的發(fā)現(xiàn)微小(癌)轉(zhuǎn)移灶。對乳腺癌而言主要是腋窩淋巴結(jié)的檢測，淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移患者預(yù)后差，這對進(jìn)一步治療和預(yù)后判斷十分有意義。

2.8與治療和預(yù)后有關(guān)的免疫組化標(biāo)記物

與治療及預(yù)后有關(guān)的標(biāo)記物主要分以下為三類:(1)腫瘤基因標(biāo)記物:如癌基因C-erbB2、c-myc、P53蛋白等，卵巢上皮性癌中P53的過表達(dá)與腫瘤的擴散、分化、術(shù)后殘存癌灶呈正相關(guān);乳腺癌中表達(dá)C-erbB2的浸潤性癌患者預(yù)后差;肺癌中突變型P53基因蛋白表達(dá)增高，PTEN基因表達(dá)減弱，提示腫瘤預(yù)后不良。(2)細(xì)胞增殖性標(biāo)記物:腫瘤細(xì)胞增生是否活躍直接影響者臨床的治療與預(yù)后，如表皮生長因子受體(EGFR)、Ki-67、PCNA、cycling等可對腫瘤細(xì)胞的增生做出評價，表達(dá)指數(shù)越高，表明其增殖指數(shù)越活躍，惡性度增高，預(yù)后不良，其中以惡性淋巴瘤、乳腺癌較為明顯;在對乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)Ki-67、EGFR陽性者，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高，并與激素受體的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。(3)類固醇激素受體:如雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)等，應(yīng)用最為廣泛的是子宮內(nèi)膜癌及乳腺癌，如對乳腺癌中ER、PR的檢測，有助于決定臨床治療中是否需要加入內(nèi)分泌激素阻斷治療，并能判斷預(yù)后，ER及PR陽性表達(dá)、原癌基因(C-erbB-2)陰性表達(dá)病例對三苯氧胺等激素治療反應(yīng)良好，而ER、PR、C-erbB-2三種抗體均陰性(TNBC)患者采用三苯氧胺可能意義不大。

2.9對感染性疾病診斷

應(yīng)用抗病毒、細(xì)菌、真菌和寄生蟲抗原的特異性抗體進(jìn)行免疫組化染色，可以檢測和診斷許多感染性疾病病原微生物，如乙型肝炎病毒(HBV)、巨細(xì)胞病毒(CMV)、人乳頭狀瘤病毒(HPV)、皰疹病毒(HSV)、丙型肝炎病毒(HVC)、細(xì)小病毒B19、人禽流行性感冒病毒(AIV)、嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒(SARS)等等，由于免疫組化在感染性疾病診斷中具有及時性、低風(fēng)險性、高敏感性、特異性、有效性等特點，可以用于(1)用于人類新病原微生物的識別;(2)提供快速的形態(tài)學(xué)診斷，使嚴(yán)重感染性疾病得以早期治療;(3)在無法取得新鮮組織或尚無培養(yǎng)方法的情況下，提供診斷并對發(fā)病機制進(jìn)行研究和認(rèn)識。

2.10藥物靶點免疫組化

免疫組化及分子病理學(xué)方法在疾病診斷中僅僅起輔助治療的作用，而藥物病理學(xué)是用病理學(xué)的方法確定藥物治療的靶點、評價藥物治療的療效、預(yù)測藥物治療的反應(yīng)，因此藥物靶點免疫組化屬“獨立診斷”。因此對于對照的設(shè)置、質(zhì)量的控制均需要更高的要求，如對試劑的要求，不同于一般的診斷試劑，應(yīng)按對藥物管理的要求操作。HER2蛋白著色3+者可作為臨床醫(yī)生建議患者接受曲妥珠單抗等藥物治療的依據(jù)。

3、免疫組化的局限性

靈敏度高、精確性和特異性是一種理想的腫瘤標(biāo)記物必須具有的，但至今所發(fā)現(xiàn)的腫瘤標(biāo)記物還沒有能完全滿足這些標(biāo)準(zhǔn)。某些正常細(xì)胞也分泌一些腫瘤標(biāo)記物，因此腫瘤細(xì)胞學(xué)并不是單獨產(chǎn)生一種標(biāo)記物，即選用一組抗體比單一抗體更有利。在腫瘤診斷中評估免疫組化的局限性主要在抗體特異性和解釋方面。在免疫組化操作中都必須有適當(dāng)?shù)年栃耘c陰性對照，作為技術(shù)完整性質(zhì)量控制，如對照組被忽略或不理想時，免疫組化染色的結(jié)果要謹(jǐn)慎對待，免疫組化的正確結(jié)果不僅要依靠技術(shù)步驟上規(guī)范化操作，而且有賴于正確的解釋，在報告免疫組化染色結(jié)果時不應(yīng)孤立地解釋，應(yīng)考慮到診斷與鑒別診斷、所應(yīng)用的抗體特性、所研究組織性質(zhì)，同時還要注意假陽性與假陰性結(jié)果的干擾。

3.1假陽性

陽性信號定位不正確即為假陽性，包括著色不勻、背景著色、邊緣效應(yīng)，另外組織的某些特定成分也能導(dǎo)致假陽性結(jié)果。假陽性可能的原因有:(1)一抗?jié)舛燃耙豢故欠袷�效，抗體有一個合適的濃度范圍且必須在有效期內(nèi)使用，過期的抗體或者不著色，或者背景著色，形成假陽性;(2)試劑未充分覆蓋組織，組織邊緣的試劑易干濃度較組織中間高致深染;(3)抗體孵育時間過長，由于室溫的影響夏季孵育時間稍短，冬季孵育時間稍長;(4)操作過程中組織變干，造成組織邊緣收縮或損壞形成偽影，產(chǎn)生假陽性;(5)3，3'-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色時間太長，DAB宜現(xiàn)配現(xiàn)用，配制時間最好在30min以內(nèi);(6)由于胞漿里含有較多的蛋白質(zhì)，因此間質(zhì)和胞漿中出現(xiàn)很多非特異性的染色，如內(nèi)源性酶血紅蛋白、肌紅蛋白等造成的著色，可以通過血清封閉解決;乳腺癌組織中的脂肪細(xì)胞、淋巴細(xì)胞也會產(chǎn)生非特異性的染色;(7)非特異性抗體吸附常見于壞死組織中，使壞死組織呈較高的背景染色，在免疫組化中應(yīng)避免選擇壞死組織較多的蠟塊。

3.2假陰性

免疫組化結(jié)果中的假陰性是指所有抗體標(biāo)記的切片均呈陰性，無陽性信號，假陰性結(jié)果不是真實的反應(yīng)。導(dǎo)致假陰性結(jié)果的原因有:(1)抗原修復(fù)方法選擇不當(dāng)，根據(jù)不同的抗原特點采用不同的修復(fù)方法，大多數(shù)抗體要求熱修復(fù)，熱修復(fù)又包括高壓修復(fù)、微波修復(fù)及煮沸熱修復(fù);而對某些細(xì)胞內(nèi)抗原和細(xì)胞間質(zhì)抗原需要用酶消化，如表皮生長因子(EGFR)要求胃蛋白酶(Pepsin)消化，而Vimentin則不用修復(fù);(2)一抗本身的問題:一抗效價降低或失效。在免疫組化中染色結(jié)果的假陰性會導(dǎo)致錯診或漏診，進(jìn)而影響臨床診斷及延誤治療。解決這一問題的可通過設(shè)立陽性對照，比較兩者染色結(jié)果。若陽性對照有表達(dá)，表明試劑和染色體系及實驗步驟均無問題;若陽性對照無表達(dá)，則檢測過程中某一試劑或某個步驟存在問題，應(yīng)逐一查找原因。

4、免疫組化的質(zhì)量控制

免疫組化染色切片的好壞直接影響著病理醫(yī)生對其染色結(jié)果的判斷，進(jìn)而影響病理診斷，所以制作一張良好的免疫組化切片至關(guān)重要，它需要病理醫(yī)生與病理技師兩者間的相互協(xié)調(diào)，密切配合和共同努力，病理醫(yī)生選擇抗體，設(shè)置對照，判讀結(jié)果，指導(dǎo)技術(shù);而技術(shù)人員進(jìn)行實驗操作，保證染色質(zhì)量。在免疫組化切片的制作過程存在多個環(huán)節(jié)，每一環(huán)節(jié)的失誤都可能影響最終的檢測結(jié)果，如抗原保存，蛋白酶消化，增強技術(shù)及對抗體的管理、使用和試劑的濃度等等，因此制作一張高質(zhì)量的免疫組織化學(xué)切片是多方面相互配合的結(jié)果。

為了保證免疫組化染色結(jié)果的可靠性，每個實驗室都必須進(jìn)行有效的質(zhì)量控制，規(guī)范免疫組化操作流程與步驟，應(yīng)注意以下幾點:(1)規(guī)范行為技術(shù)標(biāo)準(zhǔn):例如使用中性福爾馬林(添加PBS的4%福爾馬林)固定，并且固定及時、烤片不宜時間過長及浸蠟溫度不宜過高等等，溫度過高會破壞抗原決定簇，產(chǎn)生假陰性;(2)試劑最佳濃度:試劑最佳濃度的確定受到固定方法、時間、組織處理過程的影響;最合適的稀釋度是以得到最大強度的特異性染色和最弱的背景染色為標(biāo)準(zhǔn);(3)為了保證免疫染色的質(zhì)量，主要的步驟便是對照的設(shè)立，包括陽性對照、陰性對照和空白對照，須同時設(shè)立，以達(dá)到最佳的質(zhì)控效果。對已知存在抗原的陽性對照組，如含抗原的正常組織，最好是使用含少量抗原的瘤組織作為對照，使與所檢測切片中的抗原水平趨于一致，而且后者可能含有表達(dá)抗原的非瘤組織，可以作為內(nèi)部對照;陰性對照應(yīng)用缺乏抗原的組織切片;空白對照可以采用非免疫血清，緩沖液取代初級抗原的位置。總之，只有陽性對照染色陽性，陰性對照組織陰性，這樣的免疫組化染色結(jié)果才有說服力;(4)抗原修復(fù)的一致性:抗原熱修復(fù)工具選用微波爐或高壓鍋，修復(fù)溫度及修復(fù)時間要盡量一致，修復(fù)溫度至少要達(dá)到100℃，且修復(fù)總時間不低于15min;修復(fù)液的PH值在7．0～8．0之間，如Tris(pH7～8)、EDTA(pH8．0)修復(fù)液;(5)熟悉抗體的陽性定位:每種抗體均有陽性定位，染色之前應(yīng)確定該抗體陽性位置，是胞漿、胞膜或胞核，如ER、PR、P53、Ki-67定位于細(xì)胞核，若胞質(zhì)或胞膜陽性也為假陽性;CD4、CD5、CD8、CD20、CD30、C-erbB-2等定位于細(xì)胞膜，若胞質(zhì)彌漫陽性或細(xì)胞核陽性則為假陽性;還有的抗體可表現(xiàn)為二種陽性反應(yīng)類型，如S-100可為核陽性也可伴有胞質(zhì)陽性;癌胚抗原(CEA)定位于胞漿或包膜。

在病理診斷中，隨著各種抗體新的用途不斷被發(fā)現(xiàn)及越來越多的新型抗體的出現(xiàn)，免疫組化在病理診斷和治療中已有了很重要的位置，對于腫瘤診斷、鑒別診斷、分類及諸多方面產(chǎn)生了重大的影響。但是免疫組化技術(shù)還存在著缺陷和不足，作為病理醫(yī)生和病理技術(shù)人員不僅要充分認(rèn)識到缺陷和不足，而且要努力避免由于缺陷和不足給診斷帶來的誤區(qū)，這就要求病理醫(yī)生和病理技術(shù)人員在工作中不斷學(xué)習(xí)與研究，在實際操作中總結(jié)經(jīng)驗教訓(xùn)，分析失敗原因，努力實現(xiàn)操作規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化，才能充分發(fā)揮免疫組化在病理診斷及鑒別診斷、臨床治療中的指導(dǎo)作用。