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結(jié)直腸癌是世界第三高發(fā)的惡性腫瘤，近年來我國(guó)結(jié)直腸癌發(fā)病率和死亡率正逐年上升，結(jié)直腸癌早期治療效果很好，但由于早期癥狀隱匿，患者確診時(shí)大多已發(fā)展到中晚期，錯(cuò)過了最佳治療時(shí)期。因此急需尋找一種非侵襲性的、快速、簡(jiǎn)便的診斷方法，早期診斷標(biāo)志物便是一種很好的方法，但當(dāng)前診斷結(jié)直腸癌的血清標(biāo)志物仍比較匱乏，常用的如癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)等。

外泌體(extracellular vesicles，exosomes)是廣泛存在于血細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等各類細(xì)胞中的囊泡樣結(jié)構(gòu)，在生理和病理狀態(tài)下均可釋放，由于EVs含有受體、生物活性脂質(zhì)、蛋白、核酸等，故其可向受體細(xì)胞傳遞重要的遺傳信息，是細(xì)胞間信號(hào)傳遞的重要途徑，近期許多研究已表明，外泌體內(nèi)包含的許多重要蛋白可以用于腫瘤的早期診斷，本研究通過分離并檢測(cè)結(jié)直腸癌患者與健康人血清外泌體CEA的濃度，探究血清外泌體CEA用于結(jié)直腸癌診斷的可能性。

01

材料和方法

一、材料

1．主要儀器與試劑：

透射電子顯微鏡(PHILIPS公司)，Zetaview可視化納米粒度儀(德國(guó)Particlemetrix公司)，酶標(biāo)儀(Thermo Fisher公司)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)CEA試劑盒購(gòu)自上海武昊公司。血清CEA檢測(cè)采用美國(guó)羅氏公司Cobas e601型全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及原裝試劑。兔抗人HSP70抗體、兔抗人CD63購(gòu)自美國(guó)santacruz公司，羊抗鼠IgG二抗購(gòu)自美國(guó)CellSignaling公司。

2．血清來源：

選擇同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院胃腸外科2015年10月至2016年12月確診結(jié)直腸癌病例血清標(biāo)本64例，其中男38例，女26例，年齡39～85歲，平均年齡(59±13)歲，其中分為血清CEA正常病例組41例(經(jīng)電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)血清CEA濃度值在正常參考范圍內(nèi))及血清CEA增高病例組23例。選擇同期良性結(jié)直腸疾病患者血清標(biāo)本20例作為良性疾病對(duì)照組，其中男9例，女11例，年齡34 ～78歲，平均年齡(57±11)歲。選同期40例同濟(jì)醫(yī)院健康體檢者作為正常對(duì)照組，其中男18名，女22名，年齡19～70歲，平均年齡(48±14)歲，年齡和性別與病例研究對(duì)象相匹配。結(jié)直腸癌患者診斷標(biāo)準(zhǔn)及分期、分型標(biāo)準(zhǔn)均依據(jù)美國(guó)腫瘤聯(lián)合會(huì)第八版癌癥分期系統(tǒng)[5]，見表1。所有入組患者均空腹采集靜脈血5 ml，室溫靜置30 min后3 000×g離心15min, 分離血清，－80 ℃冷凍保存。本研究經(jīng)過同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書[(同)倫審-KYSB-2015-(10)]。

表1 結(jié)直腸癌病例組臨床分期情況(例數(shù))

二、方法

1．血清外泌體提取：

血清標(biāo)本取出室溫復(fù)溶后，3 000×g離心15 min，去除殘留細(xì)胞及細(xì)胞碎片，吸上清液250 μl至新管，加入ExoQuick試劑63 μl，充分混勻，室溫靜置30 min，1 500×g離心30min，棄上清，再次1 500×g離心5 min，棄盡上清，所得沉淀即為外泌體外泌體。

2．透射電鏡下觀察外泌體：

將離心所得的外泌體沉淀物用100 μl的磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffer saline，PBS)重懸，取20 μl重懸液載樣于銅網(wǎng)上，室溫靜置2 min，用濾紙從濾網(wǎng)側(cè)面小心吸干液體，滴加3%的磷鎢酸溶液20 μl，室溫下復(fù)染3min，用濾紙從濾網(wǎng)側(cè)面小心吸干復(fù)染液，雙蒸餾水洗滌銅網(wǎng)5次，室溫自然干燥后，透射電子顯微鏡下觀察及拍照。

3．Zetaview可視化納米粒度儀鑒定血清外泌體：

將所得的外泌體沉淀物用100 μl PBS重懸，充分混勻后，將所得樣品用PBS進(jìn)行1∶50 000稀釋，并充分混勻，取混勻后樣品300 μl上機(jī)，用Zetaview可視化納米粒度儀進(jìn)行粒徑和濃度分析。

4．WesternBlot檢測(cè)：

采用BCA法對(duì)外泌體蛋白定量，根據(jù)定量結(jié)果調(diào)整蛋白濃度，分別取外泌體沉淀物和去除外泌體的血清樣品各20 μg，進(jìn)行Western Blot檢測(cè)。10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯胺凝膠電泳(Sodiumdodecyl sulfate-Polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)，將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)印(4 ℃，250 mA，60 min)至PVDF，室溫封閉1 h，分別加入兔抗人CD63和HSP70單克隆抗體(1∶2 000稀釋)，4 ℃孵育過夜，次日用1×TBST洗膜，與辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗(1∶2 000稀釋)室溫反應(yīng)60 min，洗膜，利用ECL化學(xué)發(fā)光劑(CST公司)顯影，壓片。

5．ELISA法檢測(cè)血清及外泌體CEA濃度：

去除殘留細(xì)胞及細(xì)胞碎片的血清樣本用1×PBS 500倍稀釋，外泌體沉淀用100 ml RIPA裂解液在冰上裂解半小時(shí)，充分振蕩混勻，用1×PBS 3倍稀釋。在CEA抗體包被的微孔板分別加標(biāo)準(zhǔn)品，空白對(duì)照，各組稀釋后的血清及外泌體樣品各100 μl，37 ℃孵育60 min，甩掉微孔板中液體，拍干，加入A液，37 ℃孵育60 min，洗板3次，加入B液37 ℃孵育30 min，洗板5次，加90 μl底物，37 ℃避光孵育15 min，再加50μl終止液，立即在450 nm波長(zhǎng)測(cè)定。

6．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，經(jīng)K-S檢驗(yàn)，各組數(shù)據(jù)呈偏態(tài)分布，計(jì)量資料采用最小值-最大值(中位數(shù))的形式表示，組間兩兩比較用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。采用受試者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲線評(píng)價(jià)各指標(biāo)對(duì)結(jié)直腸癌的診斷效能，各指標(biāo)曲線下面積比較用Z檢驗(yàn)，以P<0. 05作為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

02

結(jié)果

一、血清外泌體

使用ExoQuick試劑盒對(duì)人血清外泌體提取，所有血清樣本均提取到淡黃色脂樣沉淀，即外泌體沉淀外泌體。

二、血清外泌體的形態(tài)特征

1．形態(tài)學(xué)鑒定：

透射電鏡下觀察，外泌體提取物均呈圓形或類圓形的小囊泡，直徑約40～100 nm，包膜完整，背景清晰，未見細(xì)胞碎片，如圖1。

圖1人血清外泌體透射電鏡觀察圖，箭頭所示為外泌體(×46 000倍)

2．Zetaview可視化納米粒度儀鑒定血清外泌體：

利用Zetaview可視化納米粒度儀對(duì)外泌體懸液內(nèi)的粒子進(jìn)行動(dòng)態(tài)檢測(cè)，結(jié)果提示，健康體檢者血清外泌體的直徑主要集中在40～150 nm，最大分布峰值為95.1nm，占比97.5%，濃度為3.9×1012個(gè)/ml，結(jié)直腸癌患者血清外泌體的直徑主要集中在40～160 nm，最大分布峰值為99.5 nm，占比98.4%，濃度為3.3×1012個(gè)/ml，如圖2。

圖2 正常對(duì)照組(A圖)　與結(jié)直腸癌病例組(B圖)　血清外泌體的Zetaview可視化納米粒度儀粒徑分布

3．Westernblot檢測(cè)外泌體表面標(biāo)記蛋白CD63、HSP70：

血清外泌體樣本中可見明顯的外泌體標(biāo)志物CD63和HSP70的表達(dá)條帶，而去除外泌體的血清上清液中二者均未能檢測(cè)到，如圖3。

圖3 Western bolt檢測(cè)外泌體表面標(biāo)記蛋白

三、ELISA法檢測(cè)結(jié)直腸癌病例組、良性疾病對(duì)照組與正常對(duì)照組血清外泌體CEA濃度情況

ELISA法檢測(cè)證實(shí)人血清外泌體中存在CEA。64例結(jié)直腸癌病例組外泌體CEA濃度為(1 056.36～28637.78)pg/ml，明顯高于良性疾病對(duì)照組(394.61～2 437.83)pg/ml以及正常對(duì)照組(610.89～2 076.70)pg/ml，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(分別U＝124.000，U＝119.000；均P<0.001)；結(jié)直腸癌病例組外泌體CEA與血清CEA正常病例組(1056.36～5 832.07)相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(U＝1 002.000，P＝0.042)；血清CEA增高病例組(2 379.32～28637.78)與良性疾病對(duì)照組、血清CAE正常病例組及正常對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(分別U＝68.000，U＝72.000，U＝62.000，均P<0.001)；血清CEA正常病例組外泌體CEA與良性疾病對(duì)照組和正常對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(U＝113.000，U＝119.000；均P<0.001)，見表2。

表2 各組間CEA結(jié)果比較(pg/ml)

四、ELISA法檢測(cè)結(jié)直腸癌病例組、良性疾病對(duì)照組與正常對(duì)照組血清CEA濃度情況

ELISA法檢測(cè)41例CEA正常病例組血清CEA濃度為(15 298.01～75938.02)pg/ml，與良性結(jié)直腸疾病患者血清CEA濃度(31144.97～58 632.76)pg/ml比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(U＝405.000，P>0.05)，與健康對(duì)照組血清中CEA濃度(9 688.32～57950.80)pg/ml比較差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(U＝664.000，P>0.05)；血清CEA增高病例組(26 704.16～578 230.74)與良性疾病對(duì)照組、血清CAE正常病例組及正常對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(分別U＝56.000，U＝34.000，U＝48.000，均P<0.001)，見表3。

表3 各指標(biāo)對(duì)診斷結(jié)直腸癌的效能比較

五、血清外泌體CEA對(duì)結(jié)直腸癌輔助診斷價(jià)值

圖4利用ROC曲線分析外泌體CEA濃度對(duì)結(jié)直腸癌的輔助診斷效能，結(jié)果顯示，血清外泌體CEA對(duì)結(jié)直腸癌診斷的ROC曲線下面積為0.954(95% CI＝0.919～0.988)，血清CEA對(duì)結(jié)直腸癌診斷的ROC曲線下面積為0.636(95% CI＝0.531～0.742)，二者相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z＝5.58，P<0.01)，說明血清外泌體CEA對(duì)結(jié)直腸癌的診斷效能優(yōu)于血清CEA，當(dāng)血清外泌體CEA的cut-off值為1648.51 pg/ml時(shí)，診斷效能最佳，此時(shí)其診斷結(jié)直腸癌的敏感度為84.4%，特異度為97.5%，表明檢測(cè)外泌體CEA濃度是診斷腸癌的一項(xiàng)良好指標(biāo)(表3)。

圖4 外泌體CEA對(duì)結(jié)直腸癌的診斷效能

03

討論

目前，外泌體分離及純化方法國(guó)際上尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，各種方法間提純的產(chǎn)量、純度及顆粒性狀的差異較大，都存在技術(shù)上的制約，目前對(duì)外周血中外泌體常用的分離方法主要有超高速差速離心法、密度梯度離心法、超濾離心法、聚合沉淀法、免疫分離法、微流控技術(shù)和色譜法等[6,7]，其中超高速差速離心法是金標(biāo)準(zhǔn)，但耗時(shí)、回收率低，尤其對(duì)血漿或血清這類黏性生物體液的分離效率較低，我們選用了快速簡(jiǎn)便的ExoQuick試劑盒來分離人血清樣本中的外泌體，并用于后續(xù)研究。

圖1顯示透射電鏡下觀察，外泌體呈圓形或橢圓形，包膜完整，背景清晰。Zetaview可視化納米粒度儀檢測(cè)結(jié)直腸癌患者外泌體直徑主要集中在40～160 nm，最大分布峰值為99.5nm，占比98.4%，濃度為3.3×1012個(gè)/ml，高于文獻(xiàn)報(bào)道[8,9,10]。雖然外泌體所含成分根據(jù)細(xì)胞及組織來源不同而有差異，但所有的外泌體都包含膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和膜融合蛋白(GTPases、Annexins和Flotillin等)、熱休克蛋白(HSP70、HSP90等)、四跨膜蛋白(CD9、CD63、CD81和CD82等)、參與多囊泡體生物合成的蛋白質(zhì)(Alix和TSG101等) 以及脂質(zhì)相關(guān)蛋白等[11]。本研究選用熱休克蛋白(heat shock proteins，HSP)和四跨膜蛋白CD63作為血清外泌體的鑒定指標(biāo)，我們通過western Blot檢測(cè)到了外泌體中這兩種蛋白質(zhì)的存在，同時(shí)也印證了ExoQuick試劑盒抽提血清外泌體方法的可行性。

大量研究表明，外泌體參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移，由于外泌體所含蛋白質(zhì)或核酸等內(nèi)含物可有效反應(yīng)來源細(xì)胞的真實(shí)特征和狀態(tài)，所以外泌體可能為腫瘤提供可靠的早期診斷標(biāo)志物及特異性治療靶點(diǎn)[12,13,14,15]，癌胚抗原CEA作為腫瘤標(biāo)志物常被用于結(jié)直腸癌的篩查，但研究發(fā)現(xiàn)，術(shù)前血清CEA升高的患者在接受治療時(shí)常已發(fā)生微小轉(zhuǎn)移灶，所以血清CEA水平升高可能預(yù)示結(jié)直腸癌患者治療后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的發(fā)生，對(duì)腫瘤早期診斷并不敏感。為了探尋結(jié)直腸癌診斷更好的標(biāo)志物，本研究分離結(jié)直腸癌患者血清外泌體，用ELISA法檢測(cè)到外泌體CEA濃度，證實(shí)人血清外泌體中存在CEA蛋白，為進(jìn)一步研究探討外泌體CEA在結(jié)直腸癌診斷中的應(yīng)用價(jià)值，我們通過ELISA法分別檢測(cè)結(jié)直腸癌病例組、同期良性疾病對(duì)照組及正常對(duì)照組血清及外泌體CEA濃度。表3中結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌病例組外泌體CEA濃度明顯高于良性疾病對(duì)照組及正常對(duì)照組，且血清CEA正常病例組外泌體CEA濃度也明顯高于良性疾病對(duì)照組及正常對(duì)照組，而血清中CEA濃度在血清CEA正常病例組與良性疾病對(duì)照組及正常對(duì)照組間卻無顯著差異，提示血清外泌體CEA檢測(cè)可增加結(jié)直腸癌患者臨床診斷的敏感性。ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，血清外泌體CEA濃度對(duì)結(jié)直腸癌診斷的ROC曲線下面積為0.954(95% CI＝0.919～0.988)，血清CEA的曲線下面積為0.636，明顯低于外泌體CEA(Z＝5.58，P<0.01)，提示與血清CEA檢測(cè)相比，血清外泌體CEA對(duì)結(jié)直腸癌的診斷效能更優(yōu)，但由于CEA是一個(gè)特異性較差的腫瘤標(biāo)志物，在其他空腔臟器腫瘤中也會(huì)升高，如胃癌、肺癌等[16]，因此，在結(jié)直腸癌的診斷中應(yīng)排除有無其他腫瘤或疾病的影響。