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個體化治療檢測技術(shù)指南（試行）》包括什么內(nèi)容？
《腫瘤個體化治療檢測技術(shù)指南（試行）》主要內(nèi)容包括腫瘤個體化治療檢測分析前、分析中和分析后質(zhì)量保證規(guī)范，從而使臨床醫(yī)生能夠了解所開展檢測項目的臨床目的、理解檢測結(jié)果的臨床意義及對治療的作用，并指導(dǎo)臨床個體化治療，提高療效，減輕不良反應(yīng)，促進(jìn)醫(yī)療資源的合理利用。
《腫瘤個體化治療檢測技術(shù)指南（試行）》適應(yīng)于誰？
指南由國家衛(wèi)生計生委個體化醫(yī)學(xué)檢測技術(shù)專家委員會制定，是國家衛(wèi)生計生委個體化醫(yī)學(xué)檢測指南的重要內(nèi)容，旨在為臨床分子檢測實驗室進(jìn)行腫瘤個體化用藥基因的檢測提供指導(dǎo)。本指南的主要適用對象為開展個體化醫(yī)學(xué)分子檢測的醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床分子檢測實驗室。
進(jìn)行個體腫瘤診斷的樣本類型
腫瘤細(xì)胞是否存在，是開展腫瘤個體化治療基因檢測的重要前提。如果要確認(rèn)腫瘤細(xì)胞存在，與病理診斷醫(yī)生密切合作是非常必要的�！赌[瘤個體化治療檢測技術(shù)指南（試行）》指出：鑒定個體腫瘤的樣本包括新鮮組織(包括手術(shù)和活檢組織)、石蠟包埋組織、胸腹水等細(xì)胞學(xué)樣本、血漿樣本這4種類型。
新鮮組織(包括手術(shù)和活檢組織)
腫瘤新鮮冷凍材料可提取出最高品質(zhì)的DNA、RNA。在手術(shù)現(xiàn)場取樣的情況也比較多，但需要在顯微鏡下確認(rèn)腫瘤細(xì)胞含量。周圍炎癥嚴(yán)重的腫瘤、黏液產(chǎn)生過高的腫瘤、病變中心廣泛纖維化的腫瘤細(xì)胞不能采集，以免產(chǎn)生假陰性結(jié)果。切割后取其中一半，并利用另一半切面制作組織標(biāo)本，然后進(jìn)行確認(rèn)。
手術(shù)切除的組織樣本理想的保存方法是迅速置于液氮中，然后保存于液氮罐或-80℃冰箱，這一過程應(yīng)在手術(shù)樣本離體后30分鐘內(nèi)完成。由于組織樣本通常需先進(jìn)行病理學(xué)分析，在分析完成后應(yīng)盡早將組織樣本置于穩(wěn)定劑中，避免核酸降解。
石蠟包埋組織（formalin-fixed paraffin-embedded，F(xiàn)FPE）
10%中性福爾馬林固定手術(shù)切除樣本，按病理學(xué)操作規(guī)范進(jìn)行取材。制作石蠟切片時，切取5片連續(xù)切片，其中1片進(jìn)行HE染色，確認(rèn)腫瘤細(xì)胞的含量。在高靈敏度檢測方法中，可考慮使用活檢標(biāo)本。
DNA容易受固定的影響，長時間（1周以上）浸泡在福爾馬林中的樣本的DNA會被片段化，不能檢出突變�；顧z材料的固定時間一般是24小時，對于穿刺等活檢樣本，固定時間控制在6~24小時為佳。
胸腹水等細(xì)胞學(xué)樣本
用胸腹水中的腫瘤細(xì)胞用于基因檢測時，必須確認(rèn)腫瘤細(xì)胞，穿刺獲得胸腹水樣本提交給細(xì)胞病理檢查之后，剩余液體冷藏/冷凍保存，也可在含有細(xì)胞成分的離心沉淀中加入含有蛋白質(zhì)變性劑的緩沖液（AL緩沖液，Qiagen公司）等室溫保存。由于細(xì)胞學(xué)樣本的腫瘤細(xì)胞含量較低，因此必須使用高靈敏度檢測方法。
血漿樣本
循環(huán)DNA(circulating free DNA，cfDNA)是存在于血漿中的游離DNA，腫瘤來源的DNA占血漿游離DNA的比例在不同腫瘤及病例中相差懸殊（0.01~93%），從而限制了外周血在腫瘤分子檢測時的應(yīng)用。目前已有多篇文獻(xiàn)證實可利用從血漿游離DNA檢出突變，但需要使用ARMS法等靈敏度非常高的檢測方法。
采集外周血提取血漿游離DNA進(jìn)行檢測，取樣時應(yīng)使用一次性密閉EDTA抗凝真空采血管，采集6~10ml全血，冷藏運(yùn)輸，6小時內(nèi)分離血漿，提取游離DNA，保存到-80℃冰箱中，并避免反復(fù)凍融。如外周血需長時間運(yùn)輸，建議用商品化的游離DNA樣本保存管，在常溫條件下，cfDNA在全血中可穩(wěn)定保存7天。
9大檢測技術(shù)，孰優(yōu)孰劣？
指南指出，腫瘤檢測實驗室按照《個體化醫(yī)學(xué)檢測質(zhì)量保證指南》要求進(jìn)行。在符合國家衛(wèi)生計生委要求的個體化醫(yī)學(xué)檢測實驗室和通過審核驗收的臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室完成。檢測方法包括Sanger測序法、焦磷酸測序法（Pyrosequencing）、新一代測序（NGS）、擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)（ARMS）-PCR法、高分辨率熔解曲線（HRM）法、數(shù)字PCR（Digital PCR）、熒光原位雜交（FISH）、免疫組化（IHC）、熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(Q-RT-PCR)這9種方法。
Sanger測序法
Sanger測序法是DNA序列分析的經(jīng)典方法，最直接的、可檢測已知和未知突變的一種方法。由于該方法可直接讀取DNA的序列，因此被認(rèn)為是基因分型的金標(biāo)準(zhǔn)。
優(yōu)點是測序長度較長，可發(fā)現(xiàn)新的變異位點，包括一些新的少見的突變形式及突變的確切類型，如點突變、片段缺失；局限性是靈敏度不高，突變等位基因需要超過20%才能檢出。對樣本中腫瘤細(xì)胞的含量和比例要求較高，一般要求腫瘤細(xì)胞含量不低于50%，如果腫瘤細(xì)胞比例低于50%，則假陰性出現(xiàn)的概率會顯著增加；不適用于活檢或細(xì)胞學(xué)樣本。
焦磷酸測序法（Pyrosequencing）
焦磷酸測序技術(shù)是一種新型的酶聯(lián)級聯(lián)測序技術(shù)，其重復(fù)性和精確性可與Sanger測序相媲美，而測序速度則大大提高，非常適合對已知的短序列進(jìn)行重測序分析。
主要優(yōu)點是檢測靈敏度為10%，相對Sanger測序法高，對體細(xì)胞突變和甲基化等可實現(xiàn)定量檢測；分型準(zhǔn)確可靠，通量較高，實驗設(shè)計靈活，可發(fā)現(xiàn)新的突變或遺傳變異；局限性是測序長度較短，不能對長片段進(jìn)行分析。檢測靈敏度中等，難以檢出低于10%的突變。不適用于活檢或細(xì)胞學(xué)樣本。
新一代測序（NGS）
NGS又稱大規(guī)模平行測序（MPS），包含多種可以一次性產(chǎn)生大量數(shù)字化基因序列的測序技術(shù)，是繼Sanger測序的革命性進(jìn)步，采用平行測序的理念，能夠同時對上百萬甚至數(shù)十億個DNA分子進(jìn)行測序，實現(xiàn)了大規(guī)模、高通量測序的目標(biāo)。不同廠家的產(chǎn)品測序原理不同，主要分為邊合成邊測序（SBS）、基于“DNA簇”和“可逆性末端終結(jié)”大規(guī)模平行測序、 4色熒光標(biāo)記寡核苷酸的連續(xù)連接反應(yīng)測序和半導(dǎo)體芯片測序。
高通量測序技術(shù)不僅可以進(jìn)行大規(guī)�；蚪M測序，還可用于基因表達(dá)分析、非編碼小分子RNA的鑒定、轉(zhuǎn)錄因子靶基因的篩選和DNA甲基化等相關(guān)研究。
高通量測序技術(shù)有三大優(yōu)點是傳統(tǒng)Sanger測序法所不具備的：第一，它利用芯片進(jìn)行測序，可以在數(shù)百萬個點上同時閱讀測序；第二，高通量測序技術(shù)有定量功能，樣品中DNA被測序的次數(shù)反映了樣品中這種DNA的豐度；第三、利用傳統(tǒng)Sanger測序法完成的人類基因組計劃總計耗資27億美元，而現(xiàn)在利用高通量測序技術(shù)進(jìn)行人類基因組測序，測序成本只需1千美金。
局限性是檢測靈敏度和測序深度相關(guān)。一般來說，NGS在腫瘤體細(xì)胞突變檢測時，檢測靈敏度為10%；已知的與腫瘤相關(guān)驅(qū)動基因數(shù)量有限，疾病表型和基因型的關(guān)系還有賴于生物信息的解讀，目前NGS應(yīng)用于腫瘤細(xì)胞突變檢測的標(biāo)準(zhǔn)化和質(zhì)量控制尚未形成共識。
擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)（ARMS）-PCR法
擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)（ARMS）是PCR技術(shù)應(yīng)用的發(fā)展，也稱等位基因特性PCR（AS-PCR）等，用于對已知突變基因進(jìn)行檢測，是目前實驗室常用的基因突變檢測方法。
主要優(yōu)點是ARMS-PCR法檢測靈敏度高，可檢測腫瘤細(xì)胞中突變比例為1%甚至更低的突變基因；局限性是只能檢測已知的突變類型，不能發(fā)現(xiàn)一些新的、未知的突變；如果檢測的突變位點或類型較多，則隨著引物數(shù)目增加出現(xiàn)非特異性結(jié)合的概率也相應(yīng)增加；當(dāng)檢測位點較多時，對DNA樣本量的需求增加。
高分辨率熔解曲線（HRM）法
高分辨率熔解曲線（HRM）是一種基于PCR新型技術(shù)，用于檢測基因變異包括未知的基因變異、單核苷酸多態(tài)性以及基因甲基化。HRM是基于在加熱過程中雙鏈變性為單鏈的原則，其分析不受堿基突變位點和種類的限制，可用于突變掃描、基因分型、序列匹配、DNA甲基化等方面的研究。
主要優(yōu)點是檢測靈敏度1%，特異性高，重復(fù)性好；封閉體系，減少污染的可能性；擴(kuò)增和檢測同時進(jìn)行，無需PCR后進(jìn)行處理；局限性是通過熔解曲線的圖不能判斷某一特異性的變異體，下游分析中檢測需要有測序等補(bǔ)充。
數(shù)字PCR（Digital PCR）
數(shù)字PCR是一種核酸分子絕對定量技術(shù)。相較于qPCR，數(shù)字PCR能夠直接數(shù)出DNA分子的個數(shù)，對起始樣品絕對定量，目前的應(yīng)用包括稀有等位基因檢測、基因表達(dá)絕對定量、核酸標(biāo)準(zhǔn)品絕對定量、二代測序文庫絕對定量等。
主要優(yōu)點是靈敏度可達(dá)0.001~0.0001%，高特異性，可檢測復(fù)雜背景下的靶標(biāo)序列；可高度耐受PCR反應(yīng)抑制劑；不必依賴對照品或標(biāo)準(zhǔn)品，可對目標(biāo)拷貝數(shù)直接進(jìn)行精確的鑒定，分析微小的濃度差異；實驗數(shù)據(jù)分析便捷，每個微滴的檢測結(jié)果以陰性、陽性判讀，數(shù)據(jù)分析自動化；可統(tǒng)計突變率，通過統(tǒng)計分析可得出靶點的突變率。
不足的是，數(shù)字PCR儀通量較低，目前通常能檢測的信號為FAM和HEX。一般單個反應(yīng)2重反應(yīng)效果最佳；數(shù)字PCR優(yōu)點是靈敏度高，但是對于DNA濃度大的樣本處理就沒有優(yōu)勢，而且核酸濃度高時，每個微滴里面包含的拷貝數(shù)不符合泊松分布；數(shù)字PCR雖然不依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線，但是每次反應(yīng)之間存在差異，短期內(nèi)不能代替qPCR，也不能代替其他金標(biāo)準(zhǔn)而作為首選方法。QX200等數(shù)字PCR儀目前僅用于科研用途，數(shù)字PCR走向臨床檢驗還需要一段時間。
熒光原位雜交（FISH）
熒光原位雜交(FISH)是通過熒光標(biāo)記的DNA探針與細(xì)胞核內(nèi)的DNA靶序列雜交，并在熒光顯微鏡下觀察分析其結(jié)果的一種分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)，主要可對基因缺失、基因融合、基因擴(kuò)增進(jìn)行檢測。
優(yōu)點是可多種熒光標(biāo)記，顯示DNA片段及基因之間的相對位置與方向，空間定位精確；靈敏、特異性好，可同時分析分裂期和間期的多個細(xì)胞，并進(jìn)行定量；可以檢測隱匿或微小的染色體畸變及復(fù)雜核型；缺點是FISH檢測對操作和判讀技術(shù)要求較高，診斷醫(yī)師必須經(jīng)過嚴(yán)格的FISH操作和結(jié)果判讀培訓(xùn)，只有經(jīng)FISH操作經(jīng)驗豐富的醫(yī)師判定的結(jié)果才具有可靠性；目前FISH檢測的成本昂貴、通量低。
免疫組化（IHC）
免疫組化（IHC）分析利用抗體和抗原之間的結(jié)合的高度特異性，借助于組織化學(xué)的方法將抗原抗體結(jié)合的部位和強(qiáng)度顯示出來，以其達(dá)到對組織或細(xì)胞中的相應(yīng)抗原進(jìn)行定性、定位或定量的研究。作為篩查工具優(yōu)于FISH，具有經(jīng)濟(jì)快捷的優(yōu)點，尤其適用于大量樣本的檢測分析。影響IHC結(jié)果的因素主要包括抗體的選擇、檢測前組織的固定，觀察者解釋方面的差別等。
熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(Q-RT-PCR)
熒光定量PCR是檢測拷貝數(shù)變化的一種快速且經(jīng)濟(jì)的技術(shù)方法，該方法技術(shù)可用于RNA表達(dá)水平檢測該技術(shù)主要優(yōu)點是檢測快速、通量高、靈敏度好，主要不足是對腫瘤組織提取RNA的質(zhì)量要求較高，在檢測基因表達(dá)量時判讀標(biāo)準(zhǔn)尚未統(tǒng)一。
FISH、IHC和Q-RT-PCR檢測ALK基因重排的優(yōu)缺點比較
指南指出，在檢測方法選擇策略上，實驗室應(yīng)優(yōu)選國際和國內(nèi)“金標(biāo)準(zhǔn)”的檢測方法，同類方法中優(yōu)先選擇結(jié)果穩(wěn)定性、重復(fù)性好、特異性高的技術(shù)，同時也應(yīng)考慮樣本量，檢測項目的多少等，綜合選擇合適的方法。由于腫瘤組織的異質(zhì)性，檢測的組織樣本中混有大量正常組織、石蠟樣本提取的DNA質(zhì)量和數(shù)量有限，就檢測靈敏度而言，目前ARMS-PCR>焦磷酸測序>Sanger測序。
在檢測腫瘤基因突變時，不能一味追求檢測方法的靈敏度，靈敏度高的檢測方法對整個實驗過程中的質(zhì)控要求更為嚴(yán)格，需防止因污染而產(chǎn)生假陽性。
在腫瘤靶基因表達(dá)檢測時，由于腫瘤樣本的不可再生性，需謹(jǐn)慎選擇使用的方法，如選用熒光定量PCR要求提取的總RNA量達(dá)1μg以上，如果腫瘤組織過小，提取的RNA量可能達(dá)不到檢測要求，此時應(yīng)考慮選用對樣本量要求低的檢測方法。
此外，藥物基因組學(xué)也已成為指導(dǎo)臨床個體化用藥、評估嚴(yán)重藥物不良反應(yīng)發(fā)生風(fēng)險、指導(dǎo)新藥研發(fā)和評價新藥的重要工具，部分上市的新藥僅限于特定基因型的適應(yīng)癥患者，為此衛(wèi)計委在頒發(fā)《腫瘤個體化治療檢測技術(shù)指南（試行）》的同時，也同步頒發(fā)了制訂了《藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測技術(shù)指南（試行）》。
為什么要制定《腫瘤個體化治療檢測技術(shù)指南（試行）》？
腫瘤個體化治療以疾病靶點基因診斷信息為基礎(chǔ)，以循證醫(yī)學(xué)研究結(jié)果為依據(jù)，為患者提供接受正確治療方案的依據(jù)，已經(jīng)成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)展的趨勢。臨床研究證實，通過檢測腫瘤患者生物樣本中生物標(biāo)志物的基因突變、基因SNP分型、基因及其蛋白表達(dá)狀態(tài)來預(yù)測藥物療效和評價預(yù)后，指導(dǎo)臨床個體化治療，能夠提高療效，減輕不良反應(yīng)，促進(jìn)醫(yī)療資源的合理利用。
腫瘤的個體化治療基因檢測已在臨床廣泛應(yīng)用，實現(xiàn)腫瘤個體化用藥基因檢測標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化，是一項意義重大的緊迫任務(wù)。
《腫瘤個體化治療檢測技術(shù)指南（試行）》從診斷項目的科學(xué)性、醫(yī)學(xué)實驗室檢測方法的準(zhǔn)入、樣本采集至檢測報告發(fā)出的檢測流程、實驗室質(zhì)量保證體系四個方面展開了相關(guān)論述，使臨床醫(yī)生能夠了解所開展檢測項目的臨床目的、理解檢測結(jié)果的臨床意義及對治療的作用；醫(yī)學(xué)實驗室為患者或臨床醫(yī)護(hù)人員提供及時、準(zhǔn)確的檢驗報告，并為其提供與報告相關(guān)的咨詢服務(wù)。檢測技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化和實驗室準(zhǔn)入及質(zhì)量保證對臨床和醫(yī)學(xué)實驗室提出了具體的要求，以最大程度的保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。
《腫瘤個體化治療檢測技術(shù)指南（試行）》是如何修訂問世的？
《腫瘤個體化治療檢測技術(shù)指南（試行）》是參考現(xiàn)行相關(guān)的法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)以及當(dāng)前認(rèn)知水平下制定的，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善，以及腫瘤個體化治療靶點基因的不斷發(fā)現(xiàn)，本技術(shù)規(guī)范相關(guān)內(nèi)容也將進(jìn)行適時調(diào)整。
指南由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院分子腫瘤學(xué)國家重點實驗室、蘇州生物醫(yī)藥創(chuàng)新中心起草，經(jīng)國家衛(wèi)生計生委個體化醫(yī)學(xué)檢測技術(shù)專家委員會、中國抗癌協(xié)會相關(guān)專業(yè)委員會、中華醫(yī)學(xué)會檢驗醫(yī)學(xué)分會、中華醫(yī)學(xué)會腫瘤學(xué)分會的專家修訂。起草人包括詹啟敏、曾益新、王玨、姬云、錢海利、李曉燕、孫石磊。
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