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（2017年第25號(hào)）
為加強(qiáng)醫(yī)療器械產(chǎn)品注冊(cè)工作的監(jiān)督和指導(dǎo)，進(jìn)一步提高注冊(cè)審查質(zhì)量，國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局組織制定了結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群耐藥基因突變檢測(cè)試劑注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則（見附件），現(xiàn)予發(fā)布�！�
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附件：結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群耐藥基因突變檢測(cè)試劑注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則
食品藥品監(jiān)管總局
2017年2月13日
結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群耐藥基因突變檢測(cè)試劑注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則
本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊(cè)申請(qǐng)人對(duì)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群耐藥基因突變檢測(cè)試劑注冊(cè)申報(bào)資料的準(zhǔn)備及撰寫，同時(shí)也為技術(shù)審評(píng)部門對(duì)注冊(cè)申報(bào)資料的技術(shù)審評(píng)提供參考。
本指導(dǎo)原則是針對(duì)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群耐藥基因突變檢測(cè)試劑的一般要求，申請(qǐng)人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用，若不適用，需闡述具體理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對(duì)注冊(cè)申報(bào)資料的內(nèi)容進(jìn)行充實(shí)和細(xì)化。
本指導(dǎo)原則是對(duì)注冊(cè)申請(qǐng)人和審查人員的指導(dǎo)性文件，但不包括注冊(cè)審批所涉及的行政事項(xiàng)，也不作為法規(guī)強(qiáng)制執(zhí)行，如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但需要詳細(xì)闡明理由，并對(duì)其科學(xué)合理性進(jìn)行驗(yàn)證，提供詳細(xì)的研究資料和驗(yàn)證資料，相關(guān)人員應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。
本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)體系以及當(dāng)前認(rèn)知水平下制定的，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善，以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，本指導(dǎo)原則相關(guān)內(nèi)容也將適時(shí)進(jìn)行調(diào)整。
一、范圍
本指導(dǎo)原則所述結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群耐藥基因突變檢測(cè)試劑是指：利用分子生物學(xué)技術(shù)，對(duì)結(jié)核病患者的臨床樣本或培養(yǎng)物樣本中的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群耐藥基因突變進(jìn)行體外定性檢測(cè)的試劑。針對(duì)該定義，需要強(qiáng)調(diào)如下幾點(diǎn)。
1.適用人群為：結(jié)核病患者。特別注意的是，對(duì)于同一注冊(cè)單元內(nèi)可同時(shí)進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測(cè)以及耐藥基因突變檢測(cè)的雙功能試劑，盡管其核酸檢測(cè)部分的適用人群為疑似結(jié)核病患者，但只有核酸陽(yáng)性才能進(jìn)行下一步的耐藥基因突變檢測(cè)，因此其耐藥基因突變檢測(cè)部分的適用人群為結(jié)核病患者。
2.適用樣本可為：
2.1痰、支氣管肺泡灌洗液或其他體液等臨床樣本或培養(yǎng)物樣本；
2.2進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群耐藥基因突變檢測(cè)的上述樣本應(yīng)為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陽(yáng)性的樣本。即：來(lái)自結(jié)核病患者的、結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陽(yáng)性的痰、支氣管肺泡灌洗液或其他體液等臨床樣本或培養(yǎng)物樣本。
3.結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陽(yáng)性的確認(rèn)方法可為：已獲國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局批準(zhǔn)上市的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群檢測(cè)試劑或臨床普遍認(rèn)可的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群鑒定方法（如：結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測(cè)試劑或傳統(tǒng)的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群培養(yǎng)鑒定方法）。
4.對(duì)于同一注冊(cè)單元內(nèi)可同時(shí)進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測(cè)以及耐藥基因突變檢測(cè)的雙功能試劑，其耐藥基因突變檢測(cè)部分適用于本指導(dǎo)原則。
本指導(dǎo)原則所述產(chǎn)品的預(yù)期用途可表述為以下三種類型：
1.申報(bào)產(chǎn)品可區(qū)分具體突變類型，結(jié)果報(bào)告具體突變類型（a類）。建議表述為：本產(chǎn)品用于體外定性檢測(cè)來(lái)自結(jié)核病患者的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陽(yáng)性的xx樣本中的yy耐藥基因突變，可檢測(cè)的突變類型包括zz，本產(chǎn)品可區(qū)分具體突變類型。
2.已知申報(bào)產(chǎn)品可檢測(cè)的具體突變類型（如：針對(duì)具體突變類型設(shè)計(jì)特異突變探針，從檢驗(yàn)原理上已知可檢測(cè)哪些突變類型），但結(jié)果不區(qū)分具體突變類型，結(jié)果報(bào)告為耐藥/敏感等（b類）。建議表述為：本產(chǎn)品用于體外定性檢測(cè)來(lái)自結(jié)核病患者的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陽(yáng)性的xx樣本中的yy耐藥基因突變，可檢測(cè)的突變類型包括zz，本產(chǎn)品不區(qū)分具體突變類型。
3.某段核酸區(qū)域的突變可導(dǎo)致對(duì)某種藥物耐藥，申報(bào)產(chǎn)品從檢驗(yàn)原理上沒有必要明確具體突變類型，結(jié)果報(bào)告為耐藥/敏感（c類）。建議表述為：本產(chǎn)品用于體外定性檢測(cè)來(lái)自結(jié)核病患者的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陽(yáng)性的xx樣本中的yy耐藥，本產(chǎn)品無(wú)法明確具體突變類型。
本指導(dǎo)原則的技術(shù)要求是基于熒光探針PCR方法確立的，對(duì)于線性雜交或基因芯片等其他核酸檢測(cè)技術(shù)，可能部分要求不完全適用或本指導(dǎo)原則所述技術(shù)指標(biāo)不夠全面，注冊(cè)申請(qǐng)人可根據(jù)產(chǎn)品特性選擇合適的方法進(jìn)行評(píng)價(jià)和驗(yàn)證，但需闡述不適用的理由，并驗(yàn)證其科學(xué)合理性，同時(shí)確認(rèn)性能評(píng)價(jià)的充分性。本指導(dǎo)原則適用于進(jìn)行首次注冊(cè)申報(bào)和相關(guān)許可事項(xiàng)變更的產(chǎn)品。
二、注冊(cè)申報(bào)資料要求
（一）綜述資料
綜述資料主要包括產(chǎn)品預(yù)期用途、產(chǎn)品描述、有關(guān)生物安全性的說(shuō)明、研究結(jié)果的總結(jié)評(píng)價(jià)以及同類產(chǎn)品上市情況介紹等內(nèi)容，其中同類產(chǎn)品上市情況介紹部分應(yīng)著重從檢測(cè)靶標(biāo)、方法學(xué)及不同基因突變類型檢出能力等方面寫明申報(bào)產(chǎn)品與目前市場(chǎng)上已獲批準(zhǔn)的同類產(chǎn)品之間的主要區(qū)別。若尚無(wú)同類產(chǎn)品批準(zhǔn)上市，則應(yīng)提交詳實(shí)充分的科學(xué)證據(jù)，包括：突變區(qū)域、突變類型與結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群表型耐藥的相關(guān)性以及突變檢測(cè)的臨床意義，證明申報(bào)產(chǎn)品的檢測(cè)靶標(biāo)具有明確的臨床意義。
綜述資料應(yīng)符合《體外診斷試劑注冊(cè)管理辦法》（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局令第5號(hào)，以下簡(jiǎn)稱《辦法》）和《關(guān)于公布體外診斷試劑注冊(cè)申報(bào)資料要求和批準(zhǔn)證明文件格式的公告》（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局公告2014年第44號(hào)）的相關(guān)要求。
（二）主要原材料的研究資料
應(yīng)提供主要原材料如引物、探針、企業(yè)參考品的選擇與來(lái)源、制備過(guò)程、質(zhì)量分析和質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)等相關(guān)研究資料。若主要原材料為企業(yè)自己生產(chǎn)，其生產(chǎn)工藝必須相對(duì)穩(wěn)定，并提交工藝驗(yàn)證報(bào)告；如主要原材料購(gòu)自其他供貨商，應(yīng)提供的資料包括：供貨方提供的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、出廠檢定報(bào)告，以及該原材料到貨后的質(zhì)量檢驗(yàn)資料。
1.核酸分離純化組分（如有）的主要組成、原理介紹及相關(guān)的驗(yàn)證資料。
2.PCR組分的主要原料（包括引物、探針、各種酶及其他主要原料）的選擇、制備、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及實(shí)驗(yàn)研究資料，主要包括以下內(nèi)容：
2.1脫氧三磷酸核苷（dNTP）
核酸的組成成分，包括：dATP、dUTP、dGTP、dCTP和dTTP；應(yīng)提交對(duì)純度、濃度以及保存穩(wěn)定性等的驗(yàn)證資料。
2.2引物
由一定數(shù)量的dNTP構(gòu)成的特定序列，通常采用DNA合成儀人工合成，合成后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）或其他適宜方法純化。需提供對(duì)分子量、純度、穩(wěn)定性以及功能性實(shí)驗(yàn)等的驗(yàn)證資料。如為外購(gòu)，還應(yīng)提供合成機(jī)構(gòu)出具的合成產(chǎn)物的質(zhì)檢證明，如PAGE結(jié)果或高效液相色譜法（HPLC）分析圖譜。
2.3探針
特定的帶有示蹤物（標(biāo)記物）的已知核酸片段（寡聚核苷酸片段），能與互補(bǔ)核酸序列退火雜交，用于特定核酸序列的探測(cè)。合成后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）或其他適宜方法純化，在5-端（和/或3-端）進(jìn)行標(biāo)記，并經(jīng)HPLC或其他適宜方法純化，純度應(yīng)達(dá)到HPLC純。應(yīng)提供合成機(jī)構(gòu)出具的合成產(chǎn)物的質(zhì)檢證明，如HPLC分析圖譜，應(yīng)對(duì)探針的分子量、純度及標(biāo)記的熒光素進(jìn)行核實(shí)，并進(jìn)行功能性試驗(yàn)驗(yàn)證。
2.4酶
DNA聚合酶，應(yīng)具有DNA聚合酶活性，無(wú)核酸內(nèi)切酶活性，具熱穩(wěn)定性，如：94℃保溫1小時(shí)后仍保持50%活性；尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG/UNG），具有水解尿嘧啶糖苷鍵的活性，無(wú)核酸外切酶及核酸內(nèi)切酶活性。應(yīng)對(duì)酶活性進(jìn)行合理驗(yàn)證。
3.核酸類檢測(cè)試劑的包裝材料和耗材應(yīng)無(wú)脫氧核糖核酸酶（DNase）污染。
4.企業(yè)參考品：詳細(xì)說(shuō)明企業(yè)參考品的原料選擇、制備和定值過(guò)程等試驗(yàn)資料。
4.1陽(yáng)性參考品
應(yīng)包括申報(bào)產(chǎn)品聲稱的全部突變類型。陽(yáng)性參考品的突變類型需經(jīng)過(guò)金標(biāo)準(zhǔn)方法或已上市同類分型試劑的確認(rèn)。常見突變類型的陽(yáng)性參考品至少有1—2種突變類型采用菌株，其他突變類型的陽(yáng)性參考品可以采用含有突變的核酸（如：結(jié)核分枝桿菌基因組DNA或質(zhì)粒），不建議采用臨床樣本（如痰液）作為陽(yáng)性參考品。注冊(cè)申請(qǐng)人可根據(jù)權(quán)威機(jī)構(gòu)的最新文件或文獻(xiàn)等確定常見突變類型，并提交相應(yīng)的支持資料。
4.2陰性參考品
可采用經(jīng)確認(rèn)靶序列未發(fā)生突變的結(jié)核分枝桿菌菌株、申報(bào)產(chǎn)品聲稱的其他無(wú)關(guān)突變類型的核酸等。
4.3最低檢測(cè)限參考品
最低檢測(cè)限參考品須含有聲稱的所有突變類型。常見突變類型的最低檢測(cè)限參考品至少有1—2種突變類型采用菌株，其他突變類型可采用含有突變的核酸。常見突變類型的確定方法可參考本指導(dǎo)原則的“4.1陽(yáng)性參考品”。
4.4精密度參考品
精密度參考品至少應(yīng)包括弱陽(yáng)性（低濃度突變型）水平，須含有申報(bào)產(chǎn)品聲稱的所有突變類型。常見突變類型的精密度參考品至少有1—2種突變類型采用菌株，其他突變類型可采用含有突變的核酸。常見突變類型的確定方法可參考本指導(dǎo)原則的“4.1陽(yáng)性參考品”。
對(duì)于c類預(yù)期用途的產(chǎn)品，申請(qǐng)人應(yīng)盡可能對(duì)國(guó)內(nèi)已報(bào)告的耐藥核酸區(qū)域內(nèi)的常見突變類型設(shè)置上述各種類型的企業(yè)參考品。常見突變類型的確定方法可參考本指導(dǎo)原則的“4.1陽(yáng)性參考品”。對(duì)于利福平耐藥基因突變檢測(cè)試劑，陽(yáng)性參考品、最低檢測(cè)限參考品以及精密度參考品至少應(yīng)包括4—5種常見突變類型，并且至少有1—2種突變類型采用菌株。對(duì)于其他藥物的耐藥基因突變檢測(cè)試劑，陽(yáng)性參考品、最低檢測(cè)限參考品以及精密度參考品至少應(yīng)包括耐藥相關(guān)的常見突變類型，并且至少應(yīng)有1—2種突變類型采用菌株，突變類型的數(shù)量可根據(jù)申報(bào)產(chǎn)品的具體情況而定。
5.試劑盒內(nèi)的對(duì)照
申報(bào)產(chǎn)品的質(zhì)控體系通過(guò)設(shè)置各種對(duì)照來(lái)實(shí)現(xiàn)，以對(duì)樣本核酸分離純化、配液及加樣、試劑及儀器性能、擴(kuò)增反應(yīng)抑制物（管內(nèi)抑制）、交叉污染和靶核酸降解等因素可能造成的假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行合理質(zhì)控。申報(bào)資料應(yīng)詳細(xì)說(shuō)明各種對(duì)照的原料選擇、制備和定值過(guò)程等。
本指導(dǎo)原則的技術(shù)要求是基于熒光探針PCR方法建立的，對(duì)于采用該方法學(xué)的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群耐藥基因突變檢測(cè)試劑，建議至少設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照、內(nèi)對(duì)照和陰性對(duì)照。
5.1陽(yáng)性對(duì)照
陽(yáng)性對(duì)照可對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程進(jìn)行質(zhì)控。陽(yáng)性對(duì)照可采用菌株、質(zhì)粒或基因組提取物等。企業(yè)應(yīng)對(duì)陽(yáng)性對(duì)照相應(yīng)判斷數(shù)值做出明確要求。
5.2內(nèi)對(duì)照
內(nèi)對(duì)照可對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程的假陰性結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制。內(nèi)對(duì)照可采用質(zhì)�；蚓�性DNA等。申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)內(nèi)對(duì)照的引物、探針和模板濃度做精確的驗(yàn)證，既要保證內(nèi)標(biāo)熒光通道呈明顯的陽(yáng)性又要盡量降低對(duì)靶核酸序列檢測(cè)造成的抑制而導(dǎo)致假陰性。企業(yè)應(yīng)對(duì)內(nèi)對(duì)照或相應(yīng)判斷數(shù)值做出明確要求。
5.3陰性對(duì)照
陰性對(duì)照可采用含有野生型靶序列的核酸或空白對(duì)照，以對(duì)交叉污染造成的假陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行質(zhì)控。陰性對(duì)照需參與樣本核酸的平行提取純化。
由于申報(bào)產(chǎn)品所適用的臨床樣本比較復(fù)雜，其中可能含有各種影響PCR反應(yīng)的抑制物，造成假陰性。因此，申報(bào)產(chǎn)品應(yīng)充分考慮對(duì)樣本核酸提取純化環(huán)節(jié)的質(zhì)量控制，通過(guò)設(shè)置各種對(duì)照進(jìn)行質(zhì)控。比如，采用克隆菌株作為內(nèi)對(duì)照或陽(yáng)性對(duì)照并參與樣本核酸的平行提取純化，或者設(shè)置專門的核酸提取純化對(duì)照（如菌株）等，以對(duì)樣本核酸提取純化的質(zhì)量及效率進(jìn)行評(píng)估。
（三）主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料
生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料應(yīng)能對(duì)反應(yīng)體系涉及到的基本內(nèi)容，如臨床樣本用量、試劑用量、反應(yīng)條件和質(zhì)控體系設(shè)置等，提供確切的依據(jù)，配制工作液的各種原材料及其配比應(yīng)符合要求，原材料應(yīng)混合均勻，配制過(guò)程應(yīng)對(duì)pH、電導(dǎo)率、離子濃度等關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行有效控制。主要包括以下內(nèi)容：
1.主要生產(chǎn)工藝介紹，可以圖表方式表示。
2.確定最佳PCR反應(yīng)體系的研究資料，包括酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度以及陽(yáng)離子濃度等。
3.PCR反應(yīng)各階段溫度、時(shí)間及循環(huán)數(shù)的研究資料。
4.對(duì)于基線閾值和閾值循環(huán)數(shù)等確定的研究資料。
5.如申報(bào)產(chǎn)品包含核酸提取純化試劑，應(yīng)提交對(duì)核酸提取純化過(guò)程進(jìn)行工藝優(yōu)化的研究資料。
（四）分析性能評(píng)估資料
申請(qǐng)人應(yīng)提交對(duì)申報(bào)產(chǎn)品進(jìn)行的所有性能驗(yàn)證的研究資料，包括具體試驗(yàn)方法、內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)分析等詳細(xì)資料。該類產(chǎn)品建議著重對(duì)以下分析性能進(jìn)行研究。
1.陽(yáng)性/陰性參考品符合率
各突變類型的陽(yáng)性參考品均應(yīng)檢出陽(yáng)性/耐藥，陰性參考品應(yīng)檢測(cè)為陰性/敏感。其中，常見突變類型至少有1—2種突變類型采用耐藥菌株，其他突變類型可采用含有突變的核酸樣本。常見突變類型的確定方法可參考本指導(dǎo)原則的“4.1陽(yáng)性參考品”。
2.最低檢測(cè)限
建議采用95%（n≥20）的陽(yáng)性檢出率作為最低檢測(cè)限確定的標(biāo)準(zhǔn)。擴(kuò)增反應(yīng)終體系中的突變序列百分率和總核酸濃度兩個(gè)因素對(duì)最低檢測(cè)限的影響較大，終體系中突變序列的百分率越高、所含的DNA量越多，則越容易檢出。而終體系中的這兩個(gè)因素是由臨床樣本中的結(jié)核分枝桿菌耐藥菌與野生菌的含量和相對(duì)比例決定的。因此，需從以下兩個(gè)方面考察申報(bào)產(chǎn)品的最低檢測(cè)限。
2.1 100%耐藥比例下，耐藥菌株/突變核酸的最低檢測(cè)濃度
將結(jié)核分枝桿菌耐藥菌株/突變核酸進(jìn)行系列稀釋，制備不同濃度的耐藥菌株/突變核酸樣本。其中，常見突變類型至少有1—2種突變類型采用耐藥菌株，其他突變類型可采用含有相應(yīng)突變的核酸樣本（如：質(zhì)�；蚧蚪MDNA）。常見突變類型的確定方法可參考本指導(dǎo)原則的“4.1陽(yáng)性參考品”。
分別對(duì)各濃度樣本進(jìn)行不少于20次的重復(fù)檢測(cè)，確定95%陽(yáng)性檢出率水平，作為可檢測(cè)的最低耐藥菌株/突變核酸濃度。
2.2不同菌株/核酸濃度、各種耐藥比例的最低檢測(cè)限。
配制不同菌株/核酸濃度、各種耐藥比例的混合液：將不同濃度的結(jié)核分枝桿菌野生菌株和耐藥菌株進(jìn)行混合，調(diào)整野生和耐藥菌株的比例，得到含不同菌株濃度和各種耐藥比例的菌株混合液。或者，將不同濃度的野生質(zhì)粒和突變質(zhì)粒進(jìn)行混合，調(diào)整野生質(zhì)粒和突變質(zhì)粒的比例，得到含不同核酸濃度和各種耐藥比例的核酸混合液。其中，常見突變類型至少有1—2種突變類型采用耐藥菌株，其他突變類型可采用含有突變的核酸樣本（如：質(zhì)�；蚧蚪MDNA）。常見突變類型的確定方法可參考本指導(dǎo)原則的“4.1陽(yáng)性參考品”。
對(duì)各份混合液進(jìn)行不少于20次的重復(fù)檢測(cè)，確定95%陽(yáng)性檢出率水平，作為不同菌株/核酸濃度、各種耐藥比例的最低檢測(cè)限。
為確定痰樣本的最低檢測(cè)限，建議將至少1株結(jié)核分枝桿菌耐藥/敏感菌株、結(jié)核分枝桿菌陰性的痰樣本進(jìn)行混合，完全按照申報(bào)產(chǎn)品的操作步驟對(duì)此“制備痰液”進(jìn)行樣本前處理、核酸提取純化和擴(kuò)增等。對(duì)結(jié)核分枝桿菌陰性痰樣本的確認(rèn)，應(yīng)采用涂片、培養(yǎng)鑒定、臨床診斷和其他已上市的核酸檢測(cè)試劑盒進(jìn)行聯(lián)合確認(rèn)。
應(yīng)明確每種菌株/核酸的來(lái)源、突變類型、濃度和制備方法等信息。
企業(yè)可采用適宜方法進(jìn)行菌株濃度的確認(rèn)，可采用鋪板計(jì)數(shù)細(xì)菌集落形成單位（colony forming unit，CFU）的方法進(jìn)行菌株濃度的確認(rèn)，以CFU/mL作為菌株濃度的表示方式；也可采用國(guó)家參考品對(duì)菌株濃度進(jìn)行標(biāo)定，以“個(gè)菌/mL”作為菌株濃度的表示方式。
3.分析特異性
3.1野生型驗(yàn)證：采用不同濃度的野生型結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果應(yīng)為敏感或陰性。
3.2申報(bào)產(chǎn)品聲稱的全部突變類型間的交叉反應(yīng)驗(yàn)證。
3.3對(duì)于痰等復(fù)雜的臨床樣本類型，鑒于可檢測(cè)樣本中可能同時(shí)含有結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和非結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，為了驗(yàn)證非結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群等其他病原體對(duì)申報(bào)產(chǎn)品的檢測(cè)結(jié)果是否造成假陰性和假陽(yáng)性結(jié)果，需對(duì)核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的臨床癥狀、采樣部位正常寄生或易并發(fā)的其他病原體進(jìn)行交叉反應(yīng)的驗(yàn)證。
用于交叉反應(yīng)研究的其他分枝桿菌具體包括：堪薩斯分枝桿菌、海分枝桿菌、土地分枝桿菌、次要分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌、戈登分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌、鳥分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、蘇加分枝桿菌、龜分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、偶然分枝桿菌、胃分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、草分枝桿菌。上述細(xì)菌均應(yīng)進(jìn)行驗(yàn)證。
用于交叉反應(yīng)研究的其他病原體具體包括：肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、大腸桿菌、表皮葡萄球菌、隱球菌、金黃色葡萄球菌、諾卡氏菌、綠膿桿菌、白色念珠菌。上述病原體均應(yīng)進(jìn)行驗(yàn)證。
對(duì)于培養(yǎng)物樣本類型，3.3項(xiàng)不適用。
4.干擾物質(zhì)
4.1潛在干擾物質(zhì)主要包括：內(nèi)源性物質(zhì)（不含待檢野生/突變靶標(biāo)的相應(yīng)臨床樣本）和外源性藥物。建議使用醫(yī)學(xué)相關(guān)水平的干擾物濃度進(jìn)行驗(yàn)證。建議申請(qǐng)人在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度（最差條件）條件下進(jìn)行評(píng)價(jià)。對(duì)于常見藥物干擾試驗(yàn)，建議參照相應(yīng)藥物藥代動(dòng)力學(xué)研究確定的治療藥物濃度添加相應(yīng)藥物進(jìn)行干擾驗(yàn)證。具體目錄參見表3。
用于干擾研究的外源性藥物具體包括：異煙肼、利福平、抗生素（如：阿莫西林、左氧氟沙星）、鼻腔噴霧劑或滴鼻劑（如：腎上腺素、羥甲唑啉、含防腐劑的氯化鈉溶液）、鼻用軟膏類（如：莫匹羅星）、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、抗病毒藥（如：扎那米韋）、鼻腔糖皮質(zhì)激素（如：倍氯米松、地塞米松、氟尼縮松、曲安西龍、布地奈德、莫美他松、氟替卡松）。上述外源性藥物均應(yīng)進(jìn)行驗(yàn)證，括號(hào)內(nèi)至少選做一種。
對(duì)于培養(yǎng)物樣本類型，4.1項(xiàng)不適用。
4.2對(duì)于培養(yǎng)物樣本，干擾物質(zhì)主要為適用培養(yǎng)基和相關(guān)藥物的干擾，應(yīng)在最低檢測(cè)限濃度/陰性條件下驗(yàn)證相關(guān)藥物和培養(yǎng)基對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，明確不產(chǎn)生干擾的最大培養(yǎng)基和藥物濃度。
5.精密度
測(cè)量精密度的評(píng)價(jià)方法并無(wú)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)可依，可根據(jù)不同產(chǎn)品特征或企業(yè)的研究習(xí)慣進(jìn)行，前提是必須保證研究的科學(xué)合理性。具體實(shí)驗(yàn)方法可以參考國(guó)內(nèi)或國(guó)外的相關(guān)文件進(jìn)行。企業(yè)應(yīng)對(duì)每項(xiàng)精密度指標(biāo)的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)做出合理要求。針對(duì)申報(bào)產(chǎn)品的精密度評(píng)價(jià)主要包括以下要求。
5.1對(duì)可能影響檢測(cè)精密度的主要變量進(jìn)行驗(yàn)證，除申報(bào)產(chǎn)品（包括提取純化組分和PCR組分）本身的影響外，還應(yīng)對(duì)不同的適用機(jī)型（如PCR分析儀）、操作者和地點(diǎn)等要素進(jìn)行相關(guān)的驗(yàn)證。
5.2 合理的精密度評(píng)價(jià)周期，例如：為期至少12天的檢測(cè)，每天至少由2人完成不少于2次的完整檢測(cè)，從而對(duì)批內(nèi)/批間、日內(nèi)/日間以及不同操作者之間的精密度進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。如有條件，申請(qǐng)人應(yīng)選擇不同的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)以對(duì)室間精密度進(jìn)行評(píng)價(jià)。
5.3 建議在以下3個(gè)濃度進(jìn)行驗(yàn)證：
5.3.1陰性樣本：靶序列未發(fā)生突變的結(jié)核分枝桿菌野生型菌株，陰性檢出率應(yīng)為100%（n≥20）。
5.3.2弱陽(yáng)性樣本：耐藥菌株/突變核酸濃度略高于申報(bào)產(chǎn)品的最低檢測(cè)限，陽(yáng)性檢出率應(yīng)高于95%（n≥20）。（弱陽(yáng)性樣本應(yīng)包括申報(bào)產(chǎn)品聲稱的所有突變類型。常見突變類型至少有1—2種突變類型采用耐藥菌株，其他突變類型可采用含有突變的核酸樣本。）
5.3.3中等陽(yáng)性樣本：耐藥菌株/突變核酸濃度約為最低檢測(cè)限的2倍或3倍，陽(yáng)性檢出率為100%且CV≤15%（n≥20）。（可選擇申報(bào)產(chǎn)品聲稱的部分突變類型進(jìn)行驗(yàn)證，但至少應(yīng)包括1株結(jié)核分枝桿菌耐藥菌株。）
6.不同樣本前處理方法和核酸提取純化方法的分析性能資料要求
如果某種樣本類型可采用幾種方法進(jìn)行樣本前處理（如：痰/痰沉淀物），申請(qǐng)人應(yīng)提交適用的樣本前處理方法（進(jìn)行全項(xiàng)目分析性能評(píng)估的樣本前處理方法除外）與后續(xù)試驗(yàn)配合進(jìn)行的性能試驗(yàn)（至少包括最低檢測(cè)限項(xiàng)目），以證明不同的樣本前處理方法不影響檢測(cè)結(jié)果。
如果某種樣本類型可采用幾種方法進(jìn)行核酸提取純化，申請(qǐng)人應(yīng)提供適用的核酸提取純化方法（進(jìn)行全項(xiàng)目分析性能評(píng)估的核酸提取純化方法除外）與后續(xù)試驗(yàn)配合進(jìn)行的性能試驗(yàn)（至少包括最低檢測(cè)限和精密度項(xiàng)目），以證明不同的核酸提取純化方法不影響檢測(cè)結(jié)果。
對(duì)于c類預(yù)期用途的產(chǎn)品，申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)國(guó)內(nèi)已報(bào)告的耐藥核酸區(qū)域內(nèi)的常見突變類型進(jìn)行上述分析性能項(xiàng)目的驗(yàn)證。常見突變類型的確定方法可參考本指導(dǎo)原則的“4.1陽(yáng)性參考品”。對(duì)于利福平耐藥基因突變檢測(cè)試劑，陽(yáng)性符合率、最低檢測(cè)限以及精密度試驗(yàn)至少應(yīng)包括4—5種常見突變類型，并且至少有1—2種突變類型采用菌株。對(duì)于其他藥物的耐藥基因突變檢測(cè)試劑，陽(yáng)性符合率、最低檢測(cè)限以及精密度試驗(yàn)至少應(yīng)包括耐藥相關(guān)的常見突變類型，并且至少應(yīng)有1—2種突變類型采用菌株，突變類型的數(shù)量可根據(jù)申報(bào)產(chǎn)品的具體情況而定。
對(duì)于適用多個(gè)機(jī)型的產(chǎn)品，應(yīng)提供如產(chǎn)品說(shuō)明書【適用儀器】項(xiàng)中所列的所有型號(hào)儀器的至少三批全性能評(píng)估資料。
（五）陽(yáng)性判斷值確定資料
對(duì)于此類試劑，陽(yáng)性判斷值確定資料主要是指Ct值/Ct值的差值/熒光信號(hào)差值等的確認(rèn)資料，建議申請(qǐng)人采用受試者工作特征（ROC）曲線的方式對(duì)申報(bào)產(chǎn)品用于結(jié)果判斷的臨界值予以確認(rèn)。有關(guān)ROC曲線分析的細(xì)節(jié)，請(qǐng)參考國(guó)內(nèi)外相關(guān)的文件。如存在灰區(qū)，應(yīng)提交灰區(qū)上下限確定的詳細(xì)研究資料。
（六）穩(wěn)定性研究資料
穩(wěn)定性研究資料主要涉及兩部分內(nèi)容，申報(bào)產(chǎn)品的穩(wěn)定性和樣本穩(wěn)定性。前者主要包括實(shí)時(shí)穩(wěn)定性（有效期）、開瓶穩(wěn)定性、復(fù)溶穩(wěn)定性、運(yùn)輸穩(wěn)定性及凍融次數(shù)限制等研究，申請(qǐng)人可根據(jù)實(shí)際需要選擇合理的穩(wěn)定性研究方案。穩(wěn)定性研究資料應(yīng)包括研究方法的確定依據(jù)、具體的實(shí)施方案、詳細(xì)的研究數(shù)據(jù)以及結(jié)論。對(duì)于實(shí)時(shí)穩(wěn)定性，應(yīng)提供至少三批樣品在實(shí)際儲(chǔ)存條件下保存至成品有效期后的研究資料。
另外，還應(yīng)提供樣本保存條件、保存時(shí)間等方面的詳細(xì)研究資料。樣本穩(wěn)定性研究主要包括核酸分離純化前樣本穩(wěn)定性和分離純化后核酸在儲(chǔ)備液中的穩(wěn)定性兩方面。在合理的溫度范圍內(nèi)選擇多個(gè)溫度點(diǎn)（應(yīng)至少包括范圍的上限和下限溫度），每間隔一定的時(shí)間段對(duì)儲(chǔ)存樣本進(jìn)行分析驗(yàn)證，從而確認(rèn)不同類型樣本的穩(wěn)定性。適于冷凍保存的樣本還應(yīng)對(duì)凍融次數(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià)。
（七）臨床試驗(yàn)研究
1.臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)的選擇
申請(qǐng)人應(yīng)當(dāng)選定不少于3家（含3家）臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)，按照相關(guān)規(guī)定開展臨床試驗(yàn)。申請(qǐng)人應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品特點(diǎn)及其預(yù)期用途，綜合不同地區(qū)人種、流行病學(xué)背景和病原微生物的特性等因素選擇臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)。
2.臨床試驗(yàn)人群：對(duì)于僅進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群耐藥基因突變檢測(cè)的單功能試劑，選擇結(jié)核病患者進(jìn)行臨床試驗(yàn)；對(duì)于同一注冊(cè)單元內(nèi)可同時(shí)進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測(cè)以及耐藥基因突變檢測(cè)的雙功能試劑，盡管其核酸檢測(cè)部分的適用人群為疑似結(jié)核病患者，但只有核酸陽(yáng)性才能進(jìn)行下一步的耐藥基因突變檢測(cè)，因此其耐藥基因突變檢測(cè)部分的適用人群為結(jié)核病患者。
3.臨床樣本的要求：進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群耐藥基因突變檢測(cè)的臨床樣本應(yīng)為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陽(yáng)性的樣本。結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陽(yáng)性的確認(rèn)方法同本指導(dǎo)原則“二范圍”第3條。
4.臨床試驗(yàn)樣本量
鑒于痰、支氣管肺泡灌洗液以及培養(yǎng)物等樣本之間差異較大，如果申報(bào)產(chǎn)品同時(shí)適用于上述幾種樣本類型，每種樣本類型的例數(shù)不少于500例。
如果申報(bào)產(chǎn)品適用于某種樣本類型的液體培養(yǎng)物和固體培養(yǎng)物，應(yīng)進(jìn)行不少于150例液體和固體培養(yǎng)物的同源比對(duì)試驗(yàn)（應(yīng)包括一定數(shù)量的陽(yáng)性和陰性樣本），證明不同的培養(yǎng)物不會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。
如果某種樣本類型適用于幾種樣本前處理方法，應(yīng)進(jìn)行不少于150例樣本的同源比對(duì)試驗(yàn)（應(yīng)包括一定數(shù)量的陽(yáng)性和陰性樣本），證明不同的樣本前處理方法不會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。
如果某種樣本類型適用于幾種核酸提取純化方法，應(yīng)進(jìn)行不少于150例樣本的同源比對(duì)試驗(yàn)（應(yīng)包括一定數(shù)量的陽(yáng)性和陰性樣本），證明不同的核酸提取純化方法不會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。
臨床試驗(yàn)應(yīng)盡量采用新鮮樣本，如采用凍存樣本應(yīng)另行說(shuō)明。
5.對(duì)比試劑
5.1對(duì)于已有同類產(chǎn)品上市的申報(bào)產(chǎn)品
如果選擇已上市同類產(chǎn)品或基因測(cè)序作為對(duì)比試劑，還需選擇至少200例樣本（敏感和耐藥分別至少100例）進(jìn)行傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)（金標(biāo)準(zhǔn)）的驗(yàn)證。
對(duì)于c類產(chǎn)品，除了還需選擇至少200例樣本（敏感和耐藥分別至少100例）進(jìn)行傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)（金標(biāo)準(zhǔn)）的驗(yàn)證外，還需對(duì)所有耐藥/陽(yáng)性樣本采用分子生物學(xué)方法進(jìn)行驗(yàn)證，以明確引起耐藥/陽(yáng)性的具體突變類型。
如果選擇傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)（金標(biāo)準(zhǔn)）作為對(duì)比方法，還需對(duì)所有耐藥/陽(yáng)性樣本采用分子生物學(xué)方法進(jìn)行驗(yàn)證，以明確引起耐藥的具體突變類型。
5.2 對(duì)于新的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群耐藥基因突變檢測(cè)試劑
對(duì)于新的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群耐藥基因突變檢測(cè)試劑，選擇傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)方法（金標(biāo)準(zhǔn)）和基因測(cè)序作為對(duì)比試劑。
5.3 陽(yáng)性樣本例數(shù)的要求
對(duì)于a類和b類產(chǎn)品，產(chǎn)品預(yù)期用途中聲稱的每種突變類型均應(yīng)具有一定的陽(yáng)性例數(shù)，每種突變類型均應(yīng)分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)于c類產(chǎn)品，應(yīng)盡量對(duì)檢測(cè)靶核酸區(qū)域內(nèi)的常見突變類型進(jìn)行驗(yàn)證。
有關(guān)測(cè)序方法的相關(guān)要求，請(qǐng)參考《結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測(cè)試劑技術(shù)審查指導(dǎo)原則》相關(guān)要求以及現(xiàn)行法規(guī)要求。
6.臨床試驗(yàn)方法、數(shù)據(jù)及統(tǒng)計(jì)分析
6.1應(yīng)在臨床試驗(yàn)方案或者臨床試驗(yàn)報(bào)告中詳細(xì)描述申報(bào)產(chǎn)品和對(duì)比試劑的具體操作步驟。
6.2臨床試驗(yàn)原始數(shù)據(jù)應(yīng)以列表的方式表示，包括樣本的申報(bào)產(chǎn)品的結(jié)果、對(duì)比試劑的結(jié)果、藥敏結(jié)果以及耐藥比例和臨床診斷（如：何種結(jié)核病）等。
6.3對(duì)臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)應(yīng)選擇合適的統(tǒng)計(jì)方法，如檢測(cè)結(jié)果一致性分析、受試者工作特征（ROC）曲線分析、陰性/陽(yáng)性符合率等。
6.4對(duì)于申報(bào)產(chǎn)品與對(duì)比試劑（對(duì)比方法）的等效性評(píng)價(jià)，常選擇交叉四格表形式總結(jié)兩種試劑的定性檢測(cè)結(jié)果，對(duì)定性結(jié)果進(jìn)行四格表卡方或kappa檢驗(yàn)以驗(yàn)證兩種試劑定性結(jié)果的一致性，統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)可以證明兩種方法的檢測(cè)結(jié)果無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在臨床試驗(yàn)方案中應(yīng)明確統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)假設(shè)，即評(píng)價(jià)申報(bào)產(chǎn)品與對(duì)比試劑（對(duì)比方法）是否等效的標(biāo)準(zhǔn)。
6.5結(jié)果差異樣本的驗(yàn)證
在數(shù)據(jù)收集過(guò)程中，對(duì)于兩種試劑檢測(cè)結(jié)果不一致的樣本，應(yīng)采用金標(biāo)準(zhǔn)（測(cè)序或藥敏試驗(yàn)）或其他合理方法進(jìn)行復(fù)核，同時(shí)結(jié)合患者的臨床病情對(duì)差異原因及可能結(jié)果進(jìn)行分析。如無(wú)需復(fù)核，應(yīng)詳細(xì)說(shuō)明理由。
7.臨床試驗(yàn)方案
臨床試驗(yàn)實(shí)施前，研究者應(yīng)從流行病學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)等多方面考慮，設(shè)計(jì)科學(xué)合理的臨床試驗(yàn)方案。各臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)的方案設(shè)置應(yīng)基本一致，且保證在整個(gè)臨床試驗(yàn)過(guò)程中遵循預(yù)定的方案實(shí)施，不可隨意改動(dòng)。整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程應(yīng)在臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)并由本實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)人員操作完成，申報(bào)單位的技術(shù)人員除進(jìn)行必要的技術(shù)指導(dǎo)外，不得隨意干涉實(shí)驗(yàn)進(jìn)程，尤其是數(shù)據(jù)收集過(guò)程。
試驗(yàn)方案中應(yīng)確定嚴(yán)格的樣本入選/排除標(biāo)準(zhǔn)，任何已經(jīng)入選的樣本再被排除出臨床試驗(yàn)都應(yīng)記錄在案并明確說(shuō)明原因。在試驗(yàn)操作過(guò)程中和判定試驗(yàn)結(jié)果時(shí)應(yīng)采用盲法以保證試驗(yàn)結(jié)果的客觀性。各臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)選用的對(duì)比試劑應(yīng)保持一致，以便進(jìn)行合理的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。另外，申報(bào)產(chǎn)品的樣本類型不應(yīng)超越對(duì)比試劑對(duì)樣本類型的要求。
8.臨床試驗(yàn)報(bào)告的撰寫
根據(jù)《體外診斷試劑臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》的要求，臨床試驗(yàn)報(bào)告應(yīng)對(duì)試驗(yàn)的整體設(shè)計(jì)及各個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)給予清晰、完整的闡述，應(yīng)該對(duì)整個(gè)臨床試驗(yàn)實(shí)施過(guò)程、結(jié)果分析、結(jié)論等進(jìn)行條理分明的描述，并應(yīng)包括必要的數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)分析方法。建議在臨床試驗(yàn)報(bào)告中對(duì)以下內(nèi)容進(jìn)行詳述。
8.1臨床試驗(yàn)總體設(shè)計(jì)及方案描述
8.1.1臨床試驗(yàn)的整體管理情況、臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)選擇、臨床主要研究人員簡(jiǎn)介等基本情況介紹。
8.1.2病例的納入/排除標(biāo)準(zhǔn)。
8.1.3樣本類型，樣本的收集、處理及保存；培養(yǎng)、鑒定、藥敏方法等。結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陽(yáng)性的確認(rèn)方法，如采用已獲國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局批準(zhǔn)上市的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測(cè)試劑作為確認(rèn)方法，應(yīng)明確生產(chǎn)廠家和醫(yī)療器械注冊(cè)證號(hào)等相關(guān)信息；如采用傳統(tǒng)的培養(yǎng)鑒定方法作為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陽(yáng)性的確認(rèn)方法，應(yīng)詳細(xì)說(shuō)明培養(yǎng)方法和鑒定方法。
8.1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法、統(tǒng)計(jì)軟件、評(píng)價(jià)統(tǒng)計(jì)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)。
8.2具體臨床試驗(yàn)情況
8.2.1申報(bào)產(chǎn)品和對(duì)比試劑的名稱、批號(hào)、有效期及所用機(jī)型等信息。
8.2.2對(duì)各試驗(yàn)機(jī)構(gòu)的病例數(shù)等情況進(jìn)行總合，建議以列表或圖示方式給出具體例數(shù)及百分比。
8.2.3質(zhì)量控制，試驗(yàn)人員培訓(xùn)、儀器日常維護(hù)、質(zhì)控品運(yùn)行情況，對(duì)檢測(cè)精密度、質(zhì)控品測(cè)量值的抽查結(jié)果評(píng)估。
8.2.4具體試驗(yàn)過(guò)程，樣本檢測(cè)、數(shù)據(jù)收集、樣本的保存條件、結(jié)果不一致樣本的校驗(yàn)等。
8.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
8.3.1數(shù)據(jù)預(yù)處理、差異數(shù)據(jù)的重新檢測(cè)或其他合理方法的復(fù)核以及是否納入最終數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、對(duì)異常值或缺失值的處理、研究過(guò)程中是否涉及對(duì)方案的修改。
8.3.2陽(yáng)性符合率、陰性符合率、總體符合率及其95%（或99%）的置信區(qū)間。
8.3.3以交叉表的形式總結(jié)兩種試劑的定性檢測(cè)結(jié)果，對(duì)定性結(jié)果進(jìn)行四格表卡方或kappa檢驗(yàn)以驗(yàn)證兩種試劑定性結(jié)果的一致性。
8.4討論和結(jié)論
對(duì)總體結(jié)果進(jìn)行總結(jié)性描述并簡(jiǎn)要分析試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)本次臨床試驗(yàn)有無(wú)特別說(shuō)明，最后得出臨床試驗(yàn)結(jié)論。
（八）產(chǎn)品說(shuō)明書
產(chǎn)品說(shuō)明書的格式應(yīng)符合《體外診斷試劑說(shuō)明書編寫指導(dǎo)原則》的要求，境外試劑的中文說(shuō)明書除格式要求外，其內(nèi)容應(yīng)盡量保持與原文說(shuō)明書一致，翻譯力求準(zhǔn)確且符合中文表達(dá)習(xí)慣。產(chǎn)品說(shuō)明書的所有內(nèi)容均應(yīng)與申請(qǐng)人提交的其他注冊(cè)申報(bào)資料保持一致，如某些內(nèi)容引自參考文獻(xiàn)，則應(yīng)采用規(guī)范格式對(duì)此內(nèi)容進(jìn)行標(biāo)注，并單獨(dú)列明文獻(xiàn)的相關(guān)信息。
結(jié)合《體外診斷試劑說(shuō)明書編寫指導(dǎo)原則》的要求，下面對(duì)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群耐藥基因突變檢測(cè)試劑說(shuō)明書的重點(diǎn)內(nèi)容進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，以指導(dǎo)注冊(cè)申報(bào)人員合理編制說(shuō)明書。
1.【預(yù)期用途】應(yīng)至少包括以下幾部分內(nèi)容：
1.1根據(jù)【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】的結(jié)果報(bào)告形式，【預(yù)期用途】第一段可表述為以下幾種情況：
1.1.1申報(bào)產(chǎn)品可區(qū)分具體突變類型，結(jié)果報(bào)告具體突變類型（a類）。建議表述為：本產(chǎn)品用于體外定性檢測(cè)來(lái)自結(jié)核病患者的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陽(yáng)性的xx樣本中的yy耐藥基因突變，可檢測(cè)的突變類型包括zz，本產(chǎn)品可區(qū)分具體突變類型。本產(chǎn)品用于對(duì)某種（類）藥物耐藥的耐藥結(jié)核病的輔助診斷。
1.1.2已知申報(bào)產(chǎn)品可檢測(cè)的具體突變類型（如：針對(duì)具體突變類型設(shè)計(jì)特異突變探針，從檢驗(yàn)原理上已知可檢測(cè)哪些突變類型），但結(jié)果不區(qū)分具體突變類型，結(jié)果報(bào)告為耐藥/敏感等（b類）。建議表述為：本產(chǎn)品用于體外定性檢測(cè)來(lái)自結(jié)核病患者的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陽(yáng)性的xx樣本中的yy耐藥基因突變，可檢測(cè)的突變類型包括zz，本產(chǎn)品不區(qū)分具體突變類型。本產(chǎn)品用于對(duì)某種（類）藥物耐藥的耐藥結(jié)核病的輔助診斷。
1.1.3某段核酸區(qū)域的突變可導(dǎo)致對(duì)某種藥物耐藥，申報(bào)產(chǎn)品從檢驗(yàn)原理上沒有必要明確具體突變類型，結(jié)果報(bào)告為耐藥/敏感（c類）。建議表述為：本產(chǎn)品用于體外定性檢測(cè)來(lái)自結(jié)核病患者的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陽(yáng)性的xx樣本中的yy耐藥，本產(chǎn)品無(wú)法明確具體突變類型。本產(chǎn)品用于對(duì)某種（類）藥物耐藥的耐藥結(jié)核病的輔助診斷。
需要特別注意如下幾點(diǎn)：
1.b類預(yù)期用途的試劑所包括的突變類型對(duì)同一種（類）藥物必須具有相同的指導(dǎo)用藥的臨床意義。
2.對(duì)于c類預(yù)期用途的試劑，申請(qǐng)人必須有充分可靠的科學(xué)證據(jù)證明某段核酸區(qū)域與某種（類）藥物具有明確的臨床意義。申請(qǐng)人必須提供科學(xué)權(quán)威的支持資料，證明：耐藥基因區(qū)域的突變可引起耐藥；耐藥基因區(qū)域的突變對(duì)同一種（類）藥物必須具有相同的指導(dǎo)用藥的臨床意義。申請(qǐng)人還應(yīng)提交耐藥基因區(qū)域內(nèi)所有堿基在國(guó)內(nèi)外的突變頻率。
1.2介紹與耐藥相關(guān)的檢測(cè)靶標(biāo)、檢測(cè)靶標(biāo)的突變位點(diǎn)和突變類型（如適用）；明確申報(bào)產(chǎn)品可檢測(cè)的突變類型或耐藥核酸區(qū)域?qū)е碌谋硇湍退幷寂R床所有表型耐藥的比例。
1.3適用人群：結(jié)核病患者。特別注意的是，對(duì)于同一注冊(cè)單元內(nèi)可同時(shí)進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測(cè)以及耐藥基因突變檢測(cè)的雙功能試劑，盡管其核酸檢測(cè)部分的適用人群為疑似結(jié)核病患者，但只有核酸陽(yáng)性才能進(jìn)行下一步的耐藥基因突變檢測(cè)，因此其耐藥基因突變檢測(cè)部分的適用人群為結(jié)核病患者。
1.4明確臨床試驗(yàn)驗(yàn)證過(guò)的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陽(yáng)性的確認(rèn)方法的相關(guān)信息。
2.【主要組成成分】
2.1說(shuō)明試劑盒包含組分的名稱、數(shù)量、比例或濃度等信息，說(shuō)明不同批號(hào)試劑盒中各組分是否可以互換。
2.2試劑盒中不包含但對(duì)該項(xiàng)檢測(cè)必須的組份，企業(yè)應(yīng)列出相關(guān)試劑/耗材的名稱、貨號(hào)及其他相關(guān)信息。
2.3如果試劑盒中不包含用于核酸提取純化的試劑組份，則應(yīng)在此注明經(jīng)過(guò)驗(yàn)證后配合使用的商品化核酸提取純化試劑盒的生產(chǎn)企業(yè)、產(chǎn)品名稱以及產(chǎn)品貨號(hào)和醫(yī)療器械備案號(hào)（如有）等詳細(xì)信息。
3.【檢驗(yàn)原理】
3.1對(duì)試劑盒檢測(cè)靶標(biāo)以及突變類型（如適用）進(jìn)行詳細(xì)描述（基因名稱和基因位置、靶序列長(zhǎng)度、突變類型（如適用）及相關(guān)特征等），對(duì)試劑盒所用探針、引物、突變或耐藥的判定終點(diǎn)等進(jìn)行詳細(xì)的介紹；對(duì)不同樣品反應(yīng)管組合、對(duì)照設(shè)置及熒光信號(hào)檢測(cè)原理等進(jìn)行介紹。
3.2試劑盒技術(shù)原理的詳細(xì)介紹，建議結(jié)合適當(dāng)圖示進(jìn)行說(shuō)明。如反應(yīng)體系中添加了相關(guān)的防污染組分（如UNG酶），也應(yīng)對(duì)其作用機(jī)理進(jìn)行適當(dāng)介紹。
4.【儲(chǔ)存條件及有效期】
說(shuō)明試劑盒的效期穩(wěn)定性、開封穩(wěn)定性、復(fù)溶穩(wěn)定性、運(yùn)輸穩(wěn)定性和凍融次數(shù)要求等，應(yīng)明確具體的儲(chǔ)存條件及有效期。
5.【樣本要求】重點(diǎn)明確以下內(nèi)容：
5.1臨床樣本的收集：建議參照《臨床技術(shù)操作規(guī)范（結(jié)核病分冊(cè)）》（中華醫(yī)學(xué)會(huì)編著）或者《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》（中國(guó)防癆協(xié)會(huì)基礎(chǔ)專業(yè)委員會(huì)編著）現(xiàn)行有效版本推薦的采樣要求或國(guó)外的同類文件，并詳細(xì)描述采樣步驟和注意事項(xiàng)。
5.2臨床樣本的前處理：建議參考《臨床技術(shù)操作規(guī)范（結(jié)核病分冊(cè)）》（中華醫(yī)學(xué)會(huì)編著）或者《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》（中國(guó)防癆協(xié)會(huì)基礎(chǔ)專業(yè)委員會(huì)編著）現(xiàn)行有效版本推薦的前處理方法或國(guó)外的同類文件，詳細(xì)描述具體的前處理方法。
5.3培養(yǎng)物樣本：詳細(xì)描述培養(yǎng)鑒定方法，包括：從患者采集的臨床樣本類型、樣本采集后處理、所用培養(yǎng)基、相關(guān)藥物和具體操作步驟等、申報(bào)產(chǎn)品從培養(yǎng)物中取樣進(jìn)行檢測(cè)的時(shí)間點(diǎn)、取樣方法和對(duì)培養(yǎng)物樣本的處理等。
5.4樣本的其他處理、運(yùn)送和保存：明確核酸提取純化前的其他處理（如離心和洗滌等）、保存條件及期限（短期和長(zhǎng)期）以及運(yùn)送條件等。冷藏/冷凍樣本檢測(cè)前是否需要恢復(fù)至室溫，凍融次數(shù)的限制等。
6.【適用儀器】所有適用的儀器型號(hào)，并提供與儀器有關(guān)的重要信息以指導(dǎo)用戶操作。
7.【檢驗(yàn)方法】詳細(xì)說(shuō)明實(shí)驗(yàn)操作的各個(gè)步驟，包括：
7.1實(shí)驗(yàn)條件：實(shí)驗(yàn)室分區(qū)、實(shí)驗(yàn)環(huán)境的溫度、濕度和空調(diào)氣流方向控制等注意事項(xiàng)。
7.2試劑配制方法和注意事項(xiàng)。
7.3詳述待測(cè)樣本及相關(guān)對(duì)照核酸提取純化的條件、步驟及注意事項(xiàng)（如適用）。
7.4擴(kuò)增反應(yīng)前準(zhǔn)備：加樣體積、順序等。
7.5 PCR各階段的溫度、時(shí)間設(shè)置、循環(huán)數(shù)設(shè)置或相應(yīng)的自動(dòng)化檢測(cè)程序及相關(guān)注意事項(xiàng)。
7.6儀器設(shè)置（如適用）：特殊參數(shù)、探針的熒光素標(biāo)記情況、對(duì)待測(cè)突變及內(nèi)標(biāo)和其他對(duì)照的熒光通道選擇等。
8.【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】
結(jié)合陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、內(nèi)對(duì)照、核酸提取純化對(duì)照（如適用）、樣本管檢測(cè)結(jié)果以及已驗(yàn)證的突變類型與耐藥之間的關(guān)系，以列表的形式詳述所有可能出現(xiàn)的結(jié)果及相應(yīng)的解釋。如存在檢測(cè)灰區(qū)（如：耐藥不確定等），應(yīng)詳述對(duì)于灰區(qū)結(jié)果的處理方式。
9.【檢驗(yàn)方法的局限性】
9.1申報(bào)產(chǎn)品僅對(duì)下述突變類型xx進(jìn)行了驗(yàn)證。對(duì)于c類產(chǎn)品，在此處明確境內(nèi)臨床試驗(yàn)做過(guò)驗(yàn)證的突變類型。
9.2 申報(bào)產(chǎn)品的檢測(cè)結(jié)果僅作為初篩結(jié)果，僅供臨床參考，用于輔助診斷結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的耐藥性，不應(yīng)作為患者耐藥的確診依據(jù)。臨床醫(yī)生應(yīng)結(jié)合患者病情、藥物適應(yīng)癥、療效及其他實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)等因素對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行綜合判斷。
9.3本產(chǎn)品僅檢測(cè)靶標(biāo)區(qū)域內(nèi)突變引起的耐藥。由其他基因或基因區(qū)域的突變、以及其他耐藥機(jī)制引起的耐藥本產(chǎn)品不能檢出。
9.4本產(chǎn)品不能用于監(jiān)測(cè)患者對(duì)于抗生素的治療進(jìn)展以及成功與否，因?yàn)榻?jīng)過(guò)抗菌治療后，細(xì)菌DNA可能仍舊存在。
9.5有關(guān)假陰性結(jié)果的可能性分析
9.5.1不合理的樣本采集、運(yùn)送及處理、樣本中細(xì)菌含量過(guò)低、核酸過(guò)度降解或擴(kuò)增反應(yīng)體系中靶標(biāo)濃度低于檢測(cè)限均有可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果。
9.5.2未經(jīng)驗(yàn)證的其他干擾或PCR抑制因子等可能會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果（如有）。
10.【產(chǎn)品性能指標(biāo)】簡(jiǎn)述以下性能指標(biāo)：
10.1對(duì)國(guó)家參考品檢測(cè)的符合情況，簡(jiǎn)要描述采用國(guó)家參考品進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果（如適用）。
10.2最低檢測(cè)限：簡(jiǎn)單介紹最低檢測(cè)限的確定方法，并明確最低檢測(cè)限結(jié)果。重點(diǎn)考慮原始模板中突變序列的百分率和擴(kuò)增終體系中核酸濃度兩個(gè)因素對(duì)最低檢測(cè)限的影響。
10.3陽(yáng)性/陰性參考品符合率。
10.4精密度：簡(jiǎn)單介紹精密度的確定方法，并明確精密度結(jié)果。
10.5分析特異性
10.5.1野生型驗(yàn)證：應(yīng)采用不同濃度的野生型樣本進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果應(yīng)均為陰性。
10.5.2可檢測(cè)突變之間的交叉反應(yīng)：如申報(bào)產(chǎn)品可檢測(cè)多種突變，還需驗(yàn)證申報(bào)產(chǎn)品聲稱的所有突變類型之間是否存在交叉反應(yīng)。
10.5.3干擾物質(zhì)驗(yàn)證：樣本中常見干擾物質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。
10.6對(duì)比試驗(yàn)研究（如有）：簡(jiǎn)要介紹對(duì)比試劑（方法）的信息、所采用的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法及統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。
11.【注意事項(xiàng)】應(yīng)至少包括以下內(nèi)容：
11.1如該產(chǎn)品含有人源或動(dòng)物源性物質(zhì)，應(yīng)給出具有潛在感染性的警告。
11.2臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)嚴(yán)格按照《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室管理辦法》（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)〔2010〕194號(hào)或現(xiàn)行有效版本）等有關(guān)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室、臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室的管理規(guī)范執(zhí)行。
（九）產(chǎn)品技術(shù)要求
產(chǎn)品技術(shù)要求應(yīng)符合《關(guān)于公布體外診斷試劑注冊(cè)申報(bào)資料要求和批準(zhǔn)證明文件格式的公告》（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局公告2014年第44號(hào)）的相關(guān)規(guī)定。申請(qǐng)人應(yīng)按照《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術(shù)要求編寫指導(dǎo)原則》的有關(guān)要求，編寫產(chǎn)品技術(shù)要求，內(nèi)容主要包含產(chǎn)品性能指標(biāo)和檢驗(yàn)方法，并以附錄的形式明確主要原材料、生產(chǎn)工藝及半成品檢定要求。
該類試劑的注冊(cè)檢驗(yàn)主要包括以下性能指標(biāo)：物理性狀、陰/陽(yáng)性參考品符合率、精密度和最低檢測(cè)限等。陽(yáng)性參考品主要考察對(duì)申報(bào)產(chǎn)品覆蓋范圍內(nèi)不同突變類型的檢測(cè)符合性，陰性參考品則重點(diǎn)對(duì)申報(bào)產(chǎn)品的分析特異性進(jìn)行驗(yàn)證。
如果申報(bào)產(chǎn)品已有相應(yīng)的國(guó)家/行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布，則產(chǎn)品技術(shù)要求不得低于國(guó)家/行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的要求。
（十）注冊(cè)檢驗(yàn)
根據(jù)《辦法》的要求，首次申請(qǐng)注冊(cè)的第三類產(chǎn)品應(yīng)該在具有相應(yīng)承檢范圍的醫(yī)療器械檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)進(jìn)行連續(xù)3個(gè)生產(chǎn)批次樣品的注冊(cè)檢驗(yàn)。對(duì)于已有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品/參考品的檢測(cè)項(xiàng)目，在注冊(cè)檢驗(yàn)時(shí)應(yīng)采用相應(yīng)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品/參考品進(jìn)行檢驗(yàn)，并符合相關(guān)要求。對(duì)于目前尚無(wú)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品/參考品的項(xiàng)目，申請(qǐng)人應(yīng)建立自己的參考品體系并提供相應(yīng)的內(nèi)部參考品。對(duì)于c類預(yù)期用途的產(chǎn)品，如果沒有國(guó)家參考品，注冊(cè)檢驗(yàn)可采用企業(yè)參考品對(duì)國(guó)內(nèi)已報(bào)告的常見突變類型進(jìn)行驗(yàn)證。常見突變類型的確定方法可參考本指導(dǎo)原則的“4.1陽(yáng)性參考品”。
三、名詞解釋
1.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) polymerase chain reaction, PCR
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種對(duì)特定的DNA或RNA片段在體外進(jìn)行快速擴(kuò)增的方法。由變性—退火—延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成。
2.熒光探針PCR
在PCR過(guò)程中利用熒光染料釋放的熒光能量的變化直接反映出PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，并通過(guò)對(duì)熒光的采集和分析以達(dá)到對(duì)原始模板量進(jìn)行分析的PCR。
3.分析特異性 analytical specificity
測(cè)量程序只測(cè)量被測(cè)量物的能力。分析特異性用于描述檢測(cè)程序在樣本中有其他物質(zhì)存在時(shí)只測(cè)量被測(cè)量物的能力。通常以一個(gè)被評(píng)估的潛在干擾物清單來(lái)描述，并給出在特定醫(yī)學(xué)相關(guān)濃度值水平的分析干擾程度。注：潛在干擾物包括干擾物和交叉反應(yīng)物。
4.精密度 precision
在規(guī)定條件下，相互獨(dú)立的測(cè)試結(jié)果之間的一致程度。精密度的程度是用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法得到的測(cè)量不精密度的數(shù)字形式表示，如標(biāo)準(zhǔn)差（SD）和變異系數(shù)（CV）。
5.最低檢測(cè)限 detection limit, limit of detection
樣品中以一定概率可被聲明與零有差異的被測(cè)量的最低值。
6.閾值循環(huán)數(shù) cycle threshold, Ct
實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增過(guò)程中，反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)指數(shù)擴(kuò)增時(shí)經(jīng)歷的循環(huán)周期數(shù)。主要的計(jì)算方式是以擴(kuò)增過(guò)程前3到15個(gè)循環(huán)的熒光值的10倍標(biāo)準(zhǔn)差為閾值，當(dāng)熒光值超過(guò)閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)則為閾值循環(huán)數(shù)（Ct）。
7.內(nèi)標(biāo) internal control在同一反應(yīng)管中與靶序列共同擴(kuò)增的一段非靶序列分子，其目的是鑒別儀器故障、試劑因素、聚合酶活性因素或樣本中存在抑制物等造成的結(jié)果不理想的原因。
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