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深圳市美凱特科技有限公司研發(fā)組

關(guān)鍵詞：化學(xué)發(fā)光；吖啶；標(biāo)記方法

化學(xué)發(fā)光分析法是分子發(fā)光光譜分析法中的一類,是指物質(zhì)在進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)時(shí),由于吸收了反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生的化學(xué)能,而使反應(yīng)產(chǎn)物分子激發(fā)至激發(fā)態(tài),受激分子由激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí),自身發(fā)出一定波長(zhǎng)的光，故化學(xué)發(fā)光檢測(cè)不需要其它光源,其背景噪音較小,檢測(cè)靈敏度高,在對(duì)復(fù)雜體系如生物樣品中低濃度的被測(cè)對(duì)象的分析中有極大的優(yōu)勢(shì)。

近年來(lái)多類化學(xué)發(fā)光物質(zhì)被用于臨床檢驗(yàn)領(lǐng)域，隨著對(duì)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)機(jī)理以及對(duì)化學(xué)發(fā)光試劑性能的影響因素的認(rèn)識(shí)的深入,國(guó)內(nèi)外研究者們?cè)O(shè)計(jì)并合成出了多種新的高光量子產(chǎn)率的化學(xué)發(fā)光試劑,它們的檢測(cè)靈敏度不斷提高,應(yīng)用范圍日益廣泛。其中光量子產(chǎn)率較高的化學(xué)發(fā)光體系主要有以下幾類: 1: 在免疫測(cè)定、寡核苷酸標(biāo)記等方面得到廣泛應(yīng)用的吖啶衍生物類; 2: 具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、易于合成、水溶性好等優(yōu)點(diǎn)而被在環(huán)境污染物、藥物等分析等研究中廣泛應(yīng)用的魯米諾衍生物; 3: 過(guò)氧草酸酯衍生物和 1,2-二氧雜環(huán)丁烷等[1]。本文參閱大量文獻(xiàn)就光量子產(chǎn)率較高的吖啶類化學(xué)發(fā)光試劑的結(jié)構(gòu)，化學(xué)發(fā)光反應(yīng)特性及應(yīng)用方面進(jìn)行綜述。

魯米諾，異魯米諾及其衍生物是最早被用作化學(xué)發(fā)光的化合物，但由于其應(yīng)用于化學(xué)發(fā)光免疫分析時(shí)發(fā)光效率低，需要配合催化劑及增強(qiáng)劑,這導(dǎo)致該體系背景發(fā)光增強(qiáng),使測(cè)量本底升高,從而限制了這一技術(shù)的靈敏度。1983年Weeks首次合成了用于化學(xué)發(fā)光免疫分析的吖啶酯AE-NHS，該吖啶酯可用于標(biāo)記抗原,抗體,特殊蛋白,DNA等生物大分子,從而實(shí)現(xiàn)生物分子的化學(xué)發(fā)光分析。它以光量子產(chǎn)率高,背景低,與蛋白,抗原,抗體等偶合后,發(fā)光效率幾乎不受影響,而成為優(yōu)良的化學(xué)發(fā)光免疫分析標(biāo)記試劑。廣大研究工作者們?cè)诖嘶�礎(chǔ)上繼而研究出多款,發(fā)光效率更高,熱穩(wěn)定性更好,水溶性更強(qiáng)的吖啶類化學(xué)發(fā)光衍生物。

  1：吖啶類化學(xué)發(fā)光物質(zhì)分為兩類,吖啶酯和吖啶磺酰胺。

1.1.吖啶酯類：（圖一）

圖一

1.2.吖啶磺酰胺類：（圖二）

圖二

2：吖啶類化學(xué)發(fā)光反應(yīng)機(jī)理的研究已經(jīng)比較成熟,其中主要經(jīng)過(guò)三個(gè)步驟:（1）過(guò)氧化氫加成吖啶環(huán)的9位碳原子,（2）在堿性條件下生成過(guò)氧負(fù)離子,分子內(nèi)進(jìn)攻羰基,離去基團(tuán)離去,生成不穩(wěn)定中間體1,2-二氧雜環(huán)丁烷酮,(3) 1,2-二氧雜環(huán)丁烷酮開(kāi)環(huán)生成吖啶酮,同時(shí)釋放光子[2]。（圖三）

圖三

根據(jù)反應(yīng)機(jī)理研究證明,當(dāng)離去基團(tuán)上R3,R4為給電子基團(tuán)時(shí)（如R3,R4 =CH3）,能起到增大空間位阻的同時(shí)降低羰基親電性,增加該化合物在水溶液中的水解穩(wěn)定性的作用,從而保證了的光量子產(chǎn)率,信噪比高,這一點(diǎn)我司已經(jīng)從合成DMAE-NHS,NSP-DMAE-NHS,NSP-DMAE-HEG-GLU-NHS和NSP-SA-NHS等吖啶類化學(xué)發(fā)光物質(zhì)得到驗(yàn)證。當(dāng)離去基團(tuán)上R3,R4為強(qiáng)吸電子基團(tuán)（如R3,R4 =F）,羰基親電性增強(qiáng),反應(yīng)加快,發(fā)光速率加快,但與此同時(shí)自身水解穩(wěn)定性降低過(guò)大,而至光量子產(chǎn)率低。當(dāng)離去基團(tuán)上R3,R4為弱吸電子基團(tuán)（如R3,R4 =Br）,總體分子穩(wěn)定性較好,光量子產(chǎn)率較高[3]。

3：吖啶NHS活化酯類化合物常用于標(biāo)記抗體,蛋白等方法：(例如：NSP-SA-NHS)

3.1.主要試劑：

NSP-SA-NHS,深圳美凱特科技有限公司;Anti-TSH McAb;Sephadex G-50,GE Healthcare;標(biāo)記緩沖液:0.1mol/L Na2CO3-NaHCO3,pH 10.1;純化緩沖液:0.lmol/L PB,pH6.3,含0.9%NaCl；封閉緩沖液:0.05mol/L PB,pH7.4,含0.9%NaCI,l%BSA,0.04%NaN3。

3.2.實(shí)驗(yàn)方法：

將100ul 1mg/ml的Anti-TSH McAb置于在2ml a標(biāo)記緩沖液中,稱取一定量的NSP-AS-NHS,溶于無(wú)水DMF中,配成濃度為6.5mmol/L的NSP-AS-NHS溶液,滴加7.5ml 6.5mmol/L的NSP-AS-NHS溶液至a溶液中,室溫下攪拌反應(yīng)1h后,加入100ul 10g/L賴氨酸反應(yīng)15min,使標(biāo)記反應(yīng)終止。標(biāo)記物NSP-AS-NHS-Anti-TSHMcAb與游離NSP-AS-NHS通過(guò)Sephadex G-50柱(1x25cm)分離,用純化緩沖液平衡并淋洗柱子,分離過(guò)程中用色譜儀監(jiān)測(cè)蛋白峰,分別測(cè)量流出液的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度和280nm處吸光度值,取發(fā)光強(qiáng)度高且吸光度大的部分,加入1%BSA后分裝冰凍保存。

4：吖啶類化學(xué)發(fā)光優(yōu)勢(shì)總結(jié)

相對(duì)于魯米諾等傳統(tǒng)化學(xué)發(fā)光物，吖啶類化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，檢測(cè)操作簡(jiǎn)便，無(wú)需催化，也不需要增強(qiáng)劑,從而降低了背景發(fā)光,提高了信噪比,干擾作用少。另外通過(guò)修飾可改變其疏水性以適合各類蛋白,抗體等標(biāo)記所需條件，且標(biāo)記后不影響光子產(chǎn)率、發(fā)光強(qiáng)度大，標(biāo)記物穩(wěn)定。

參考文獻(xiàn)

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[2] Janusz Rak, Piotr Skurski, and Jerzy Blazejowski. Towar-d an Understanding of the Chemiluminescence Accompanyi-ng the Reaction of 9-Carboxy-10-methylacridinium Phenyl Ester with Hydrogen Peroxide. J. Org. Chem.1999,64 (9): 3002–3008

[3] Larry J. Kricka. Chemiluminescence and Bioluminescence. Anal. Chem.1995,67 (12): 499–502

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