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DNA5-甲基胞嘧啶（5mC）是重要的表觀遺傳修飾，參與調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、基因組印記、表觀遺傳等多種生物學(xué)過程，是多個生物學(xué)領(lǐng)域的研究重點。5mC的異常甲基化模式與發(fā)育、衰老和癌癥等多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

亞硫酸氫鹽測序（BS-seq）是5mC檢測的金標準，但傳統(tǒng)BS-seq存在DNA損傷嚴重、高GC含量區(qū)域轉(zhuǎn)化不完全、高估5mC水平及處理時間長等不足，嚴重限制了其在低輸入或碎片化樣本中的應(yīng)用。為了解決這些限制，美國芝加哥大學(xué)何川教授團隊于2024年報道了超快速亞硫酸氫鹽測序（UBS-seq），大大縮短了反應(yīng)時間，提高了BS效率，減少了假陽性率和對5mC水平的高估。但DNA降解，特別是低輸入DNA樣本的問題，仍然是一個關(guān)鍵的挑戰(zhàn)。

近日，何川教授團隊在5mC檢測領(lǐng)域再次獲得突破，其團隊在預(yù)印本bioRxiv報道了超溫和亞硫酸氫鹽測序（UMBS-seq）技術(shù)。UMBS-seq是一種檢測5mC的方法，可以最大限度地減少DNA降解和背景噪聲。當用于低輸入量的DNA樣本時，UMBS-seq在文庫產(chǎn)量、復(fù)雜性以及轉(zhuǎn)化率方面，均優(yōu)于傳統(tǒng)BS-seq和酶法甲基化測序（EM-seq）方法。該技術(shù)對低輸入量的細胞游離DNA（cfDNA）以及基于雜交的靶向捕獲具有較高的檢測效率，這凸顯了其在5mC生物標志物檢測和疾病早期診斷等臨床應(yīng)用中的巨大潛力。

主要研究內(nèi)容

研究團隊改進了亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化。傳統(tǒng)BS-seq和EM-seq都依賴于未修飾的C轉(zhuǎn)化為尿嘧啶（U），實現(xiàn)C和5mC之間的堿基分辨。亞硫酸氫鹽介導(dǎo)的C轉(zhuǎn)化高度依賴于亞硫酸氫鹽濃度，濃度越高，轉(zhuǎn)化效率越高。研究假設(shè)，在最佳pH值下最大化亞硫酸鹽濃度允許的超溫和條件的有效的C-U轉(zhuǎn)化，從而最大限度地減少DNA損傷。為此，研究團隊調(diào)整、確定了試劑KOH和亞硫酸氫銨的最佳配方：100μL 72%亞硫酸氫銨和1μL 20μM KOH，比此前的UBS配方表現(xiàn)出更高的轉(zhuǎn)化效率（63.8%對55.6%）（圖1b）。隨后，研究確定了55°C 90分鐘的最佳反應(yīng)條件，并通過添加堿性變性步驟和DNA保護緩沖液進一步提高了亞硫酸氫鹽的效率并保持了DNA的完整性。這一改進的亞硫酸氫鹽配方和反應(yīng)方案被命名為超溫和亞硫酸氫鹽（UMBS）轉(zhuǎn)化。

圖1.UMBS-seq在各項關(guān)鍵性能指標上均優(yōu)于傳統(tǒng)的酶法及BS處理方法。

片段大小分析表明，UMBS處理造成的DNA損傷明顯小于此前的UBS方案。此外，用UMBS-seq和UBS-seq制備的文庫比較表明，UMBS-seq在所有性能指標上始終優(yōu)于UBS-seq，可產(chǎn)生更長的片段、更高的文庫產(chǎn)量、更高的轉(zhuǎn)換率、改進的GC覆蓋均勻性和更準確的DNA甲基化估計。

為了更全面地評估UMBS-seq的性能，研究團隊將其與傳統(tǒng)BS-seq、市售亞硫酸氫鹽試劑盒（EZ DNA甲基化金試劑盒）以及領(lǐng)先的酶替代品（NEBNext EM-seq試劑盒）進行了比較（圖1c-f）。與傳統(tǒng)BS-seq相比，UMBS-seq顯著減少了DNA斷裂。EM-seq和UMBS-seq在很大程度上保留了lambda DNA的完整性，EM-seq產(chǎn)生的DNA回收率明顯較低。在5ng-10pg的DNA樣本輸入水平下，UMBS-seq始終產(chǎn)生更高的文庫產(chǎn)量，表明DNA保存得到改善。與傳統(tǒng)BS-seq文庫相比，UMBS-seq文庫顯示出更高的復(fù)雜性（更低的重復(fù)率），并且性能優(yōu)于EM-seq或與之相當。UMBS-seq的片段長度與EM-seq相當，比傳統(tǒng)BS-seq的片段長得多。此外，與傳統(tǒng)BS-seq相比，UMBS-seq在CpG覆蓋均勻性方面有顯著改善，僅略低于EM-seq。

在所有DNA輸入水平中，UMBS-seq始終產(chǎn)生非常低的背景水平未轉(zhuǎn)化C（~ 0.1%），即使在最低輸入量下變化也很小。相比之下，傳統(tǒng)BS-seq顯示出較高但可接受的背景水平（<0.5%），EM-seq在較低輸入（最低輸入超過1%）下顯示出明顯較高的背景信號，并且三次重復(fù)之間的一致性較差（圖1g）。值得注意的是，EM-seq容易出現(xiàn)假陽性，大部分未甲基化的C（7.6%）的未轉(zhuǎn)化比率大于1%（圖1）。

研究團隊評估了UMBS-seq在臨床中的5mC檢測應(yīng)用，在5ng-10pg的低輸入樣本量比較了EM-seq和傳統(tǒng)BS-seq（圖2）。在所有輸入水平上，與EM-seq相比，UMBS-seq始終能產(chǎn)生更高的文庫產(chǎn)量和更大的復(fù)雜性，同時qPCR Ct值更低，復(fù)制率更低。此外，生物分析儀電泳顯示，在UMBS-seq文庫中，較長的cfDNA片段的相對豐度更高，表明與傳統(tǒng)BS-seq相比，DNA降解程度更低。值得注意的是，在插入片段大小分布方面，UMBS-seq的表現(xiàn)也與EM-seq相當。

圖2.使用低輸入量的cfDNA樣本對UMBS-seq、EM-seq和傳統(tǒng)BS-seq進行比較。

重要的是，UMBS-seq和EM-seq都表現(xiàn)出更好的基因組覆蓋范圍和更好的關(guān)鍵基因組特征表征，特別是在富含GC的調(diào)控元件中，如啟動子和CpG島。兩種方法在較低的測序深度下都比傳統(tǒng)BS-seq鑒定出更多的CpG位點，并且表現(xiàn)出更好的GC覆蓋均勻性（圖2e-f），從而更全面地分析CpG甲基化，減少假甲基化檢測。與lambda DNA的分析一致，在所有測試的輸入量中，與EM-seq和傳統(tǒng)BS-seq相比，在稀疏甲基化的CHG和CHH位點上，UMBS-seq的背景甲基化水平較低。在CpG位點，EM-seq和傳統(tǒng)BS-seq的甲基化水平相對被夸大，這表明由于其不完全轉(zhuǎn)化，高估了甲基化水平（圖2g）。值得注意的是，每種方法都準確重建了啟動子區(qū)域和基因內(nèi)5ng cfDNA的已知DNA甲基化模式。

研究團隊進一步評估了UMBS-seq在疾病生物標志物發(fā)現(xiàn)中的潛力，實現(xiàn)了比EM-seq和傳統(tǒng)BS-seq了更大的目標CpG位點覆蓋率（圖2h），強調(diào)了UMBS-seq在臨床生物標志物應(yīng)用中靶向甲基化分析的適用性和優(yōu)勢，特別是在處理具有挑戰(zhàn)性的低輸入cfDNA樣本時。

以上結(jié)果表明，在多個關(guān)鍵性能指標上，UMBS-seq優(yōu)于EM-seq，包括文庫產(chǎn)量、復(fù)雜性、C-U轉(zhuǎn)化效率，以及工作流程的簡單性和魯棒性。與傳統(tǒng)BS-seq相比，UMBS-seq在所有評估參數(shù)上的性能都得到了顯著提高。

結(jié)語

UMBS-seq代表了亞硫酸氫鹽測序的重大進步。UMBS-seq最大限度地減少了DNA損傷和背景噪聲，同時保持BS-seq的魯棒性和效率。在簡化的工作流程中，UMBS-seq在關(guān)鍵指標上優(yōu)于傳統(tǒng)BS-seq和無亞硫酸氫鹽的EM-seq方法，包括文庫產(chǎn)量、復(fù)雜性、轉(zhuǎn)換率和信噪比。當與靶向捕獲相結(jié)合時，UMBS-seq能夠從低輸入cfDNA中敏感和特異性地檢測臨床相關(guān)的5mC生物標志物。總之，UMBS-seq將亞硫酸鹽化學(xué)的準確性與轉(zhuǎn)化和臨床應(yīng)用所需的實用性相結(jié)合，從而推動BS-seq在臨床領(lǐng)域的更廣泛應(yīng)用，將為5mC生物標志物的發(fā)現(xiàn)與檢測樹立新標準。

原文鏈接：

https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2025.10.09.681456v2.full