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色譜分離柱是高效液相色譜(HPLC)分離過程中的核心，必須引起HPLC色譜工作者的高度重視。目前國內(nèi)外已經(jīng)有不少廠商正在專門研發(fā)、生產(chǎn)各種不同類型的HPLC色譜柱。有些HPLC儀器的生產(chǎn)廠商，也在研發(fā)、生產(chǎn)HPLC色譜柱，與自己生產(chǎn)的高壓恒流泵、檢測器組成HPLC系統(tǒng)銷售。

由于HPLC具有高速度、高分離效率、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，所以其儀器和應(yīng)用發(fā)展很快^[1]、[2]。HPLC是一個(gè)包括高壓泵、色譜柱、檢測器的完整系統(tǒng)^[1]，對HPLC分離柱(包括填料)的研發(fā)、制造和使用，都有很高的要求、很大的難度。本文根據(jù)儀器學(xué)理論、分析檢測實(shí)踐的要求，和作者長期研發(fā)HPLC儀器、使用HPLC儀器和色譜柱的經(jīng)驗(yàn)和教訓(xùn)，重點(diǎn)討論HPLC分離柱及其有關(guān)問題，供有科技工作者參考。

HPLC色譜分離柱的核心是填料和幾何尺寸，它們都直接影響柱效;例如柱的幾何尺寸，直接影響柱效。對使用者來說幾何尺寸也非常重要。它包括：柱長、柱子內(nèi)徑、填料顆粒大小(直徑)、柱填充密度和均勻性等等。幾何尺寸種類繁多，數(shù)值各異，因篇幅所限，此不贅述。

理論塔板數(shù)(柱效)

理論塔板數(shù)(柱效)是衡量色譜柱分離效率高低的指標(biāo)，使用者希望HPLC的色譜柱分離效率高者好，所以，理論塔板數(shù)高者為好。

分離度

分離度是HPLC色譜柱一個(gè)非常重要的技術(shù)指標(biāo)。也是一個(gè)容易被生產(chǎn)者、研發(fā)者、使用者忽視的指標(biāo)。分離度通常被定義為：相鄰組分色譜峰保留值(時(shí)間)之差△t與色譜峰平均峰底(w1+w2)/2之比。常用R表示。

分離度的圖解如下所述：圖中tR1、tR2為保留時(shí)間;w1、w1為峰底寬。

分離度R等于1時(shí)，兩個(gè)色譜峰得到基本分離；R等于1.5時(shí)，兩峰得到完全(基線)分離。在定量分析中，要對色譜峰進(jìn)行積分時(shí)，最少要達(dá)到R為1，如果達(dá)到R>1.5，就可以保證積分中基本沒有誤差。

分離度的數(shù)學(xué)表達(dá)方程式^[3]

分離度方程式描述了分離度與選擇因子、柱效和容量因子之間的關(guān)系;它是評價(jià)一張色譜圖以及如何解決、開發(fā)和優(yōu)化分離方法的依據(jù)。所以，分離度是一個(gè)非常重要的性能技術(shù)指標(biāo)。

速率理論^[3]

1956年，Van Deemter提出，樣品峰在色譜柱內(nèi)的展寬原因如如下所述：

式中：

　　A 項(xiàng) 渦流擴(kuò)散/粒子間通道. 取決于顆粒大��；

　　B 項(xiàng) 分子的軸向擴(kuò)散. 反比于流速；

　　C 項(xiàng) 傳質(zhì)阻力. 正比于流速和顆粒度的平方。

核殼柱的出現(xiàn)，是近幾十年來，HPLC的重大突破之一，值得特別重視。目前月旭、納微、福立等正在研發(fā)、生產(chǎn)不同類型的核殼柱，下面對核殼柱的主要優(yōu)點(diǎn)簡單介紹之。

(1)核殼柱耐壓性好、反壓低

大多數(shù)HPLC系統(tǒng)最高限壓是6000 psi(400 bar)或更低。當(dāng)填料粒徑減小，反壓會明顯升高，使用亞2 微米的粒徑填充的色譜柱時(shí)，常常在超過6000 psi時(shí)，才可獲得最佳流速，這就需要購買更昂貴的“超高壓”設(shè)備才能獲得最佳分離性能。與3.5微米粒徑填料相比，盡管核殼柱也會產(chǎn)生稍高的反壓，但它仍能用于大多數(shù)普通的HPLC設(shè)備。

(2)柱效極高

同樣長度的色譜柱，核殼色譜柱的理論塔板數(shù)約是3.5 µm顆粒色譜柱的2倍，是5 µm顆粒的色譜柱的3倍。

(3)分離速度快

圖中顯示了在HALO Peptide ES-C18柱上多肽的快速分離，9種多肽和2種蛋白質(zhì)在60秒內(nèi)都獲得了極好的分離度。

(4)穩(wěn)定性好(重復(fù)性好、漂移小)

(5)所需溶劑少，利于環(huán)保

主要是柱子短、填料顆粒均勻、核殼型結(jié)構(gòu)等原因使流動相流徑短，從而節(jié)省了大量溶劑。

下表是以某品牌乙腈(500元/4L)為例

要充分認(rèn)識科學(xué)儀器的重要性、要重視儀器學(xué)理論

早在100多年前，著名科學(xué)家門捷列夫(1834-1907)就曾說過：“沒有測量，就沒有科學(xué)”�？茖W(xué)儀器是測量的最基本、最重要的工具�？茖W(xué)儀器的創(chuàng)新將會引發(fā)科學(xué)技術(shù)的重大突破，帶動社會經(jīng)濟(jì)的重大變革和進(jìn)步。

在國計(jì)民生中，科學(xué)儀器已顯示出非常重要的作用，可以說科學(xué)儀器已經(jīng)起到了以下作用：工業(yè)生產(chǎn)的“倍增器”、科學(xué)研究的“先行官”、軍事上的“戰(zhàn)斗力”、 國民活動中的“物化法官”等等的關(guān)鍵作用。所以廣大科學(xué)儀器研發(fā)者、生產(chǎn)者、使用者都應(yīng)該真正認(rèn)識到科學(xué)儀器的重要性。然而，目前，我國的廣大科技工作者中，還有很多人，雖說每天都在使用科學(xué)儀器，但是對儀器的認(rèn)識還是有不少差距;例如：自己使用的HPLC儀器有哪些最重要的技術(shù)指標(biāo)、哪些技術(shù)指標(biāo)對分析誤差會產(chǎn)生很大的影響。如何評價(jià)選擇分析儀器、如何選擇HPLC儀器的分析測試條件、如何保證分析誤差最小、如何得到最佳分析檢測數(shù)據(jù)等等，很多HPLC儀器使用者還是沒有搞清楚或還沒有真正完全搞清楚這些問題。其實(shí)，這些問題，從儀器學(xué)理論中，都能全面的、清楚的找到答案。儀器學(xué)理論是一門涉及到光學(xué)、機(jī)械學(xué)、電子學(xué)、計(jì)算機(jī)、使用等等各個(gè)方面的學(xué)科。它是一把金鑰匙，可以使你一通百通、可以使你研發(fā)生產(chǎn)出可靠性好的優(yōu)質(zhì)儀器，可以保證你把儀器用到最佳狀態(tài)，保證得到最佳分析檢測數(shù)據(jù)。所以，這些問題，必須引起廣大從事科學(xué)儀器研發(fā)、應(yīng)用的科技工作者們重視。

應(yīng)該充分認(rèn)識HPLC是由泵、柱、檢測器組成一個(gè)完整系統(tǒng)的特點(diǎn)^[5]

從儀器學(xué)理論和分析檢測工作的實(shí)際要求著眼，研發(fā)生產(chǎn)HPLC分離柱及其填料的廠商，應(yīng)該從整體出發(fā)，同時(shí)研發(fā)、生產(chǎn)HPLC的恒流泵和有關(guān)檢測器，以提高我國HPLC儀器整體(系統(tǒng))的水平。目前很多研發(fā)、使用HPLC的科技工作者，沒有搞清楚或沒有完全搞清楚HPLC中的泵、柱、檢測器三者的關(guān)系。目前，國內(nèi)外很多生產(chǎn)廠商只是生產(chǎn)泵、檢測器，色譜柱子大多都是外購件。我們說HPLC是一個(gè)系統(tǒng)，是指泵、柱、檢測器三者組成的一個(gè)完整的系統(tǒng)。如果只生產(chǎn)泵、檢測器，就不能說是生產(chǎn)完整的HPLC儀器，只是生產(chǎn)了HPLC的兩種部件，再買一根色譜柱組裝成一臺完整儀器后出售。所以，這樣生產(chǎn)的HPLC系統(tǒng)，到了用戶那里，總是不好用或者不大好用。而廣大使用者，由于沒有將HPLC的泵、柱、檢測器三者互相影響的關(guān)系搞清楚，所以很多使用者不能將HPLC用到最佳水平、不能得到誤差最小的最佳分析檢測數(shù)據(jù)。從儀器學(xué)理論和本人長期的研發(fā)和使用HPLC的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)來看，作者認(rèn)為HPLC的研發(fā)、使用者，應(yīng)該特別重視處理好以下幾個(gè)問題：

(1) HPLC是一個(gè)系統(tǒng)，必須將泵、柱、檢測器三者(三個(gè)部件)結(jié)合起來才能叫HPLC儀器。只有三者分別都合格，三者聯(lián)機(jī)后也合格，才能說這臺HPLC合格。三個(gè)部件有一個(gè)不合格，聯(lián)機(jī)后的整機(jī)系統(tǒng)肯定不合格。即使三個(gè)部件都合格，聯(lián)機(jī)后，也不一定合格。只有泵、柱、測器三者質(zhì)量都合格，并且聯(lián)機(jī)后整機(jī)檢測結(jié)果也合格，才能說明這臺HPLC儀器是合格的。

(2)本人長期使用過HPLC，也研發(fā)HPLC儀器，實(shí)踐使本人深深認(rèn)識到：必須將三個(gè)部件聯(lián)接起來檢驗(yàn)測試，并能達(dá)到質(zhì)量指標(biāo)要求，才能說這臺HPLC達(dá)到了質(zhì)量要求。否則，只能說是部件合格，而整機(jī)系統(tǒng)不一定能合格。為什么? 因?yàn)椋?/span>

①泵會因?yàn)橹�子問題產(chǎn)生壓力不穩(wěn)、流量不穩(wěn)定，會影響HPLC系統(tǒng)的質(zhì)量;

②柱對泵影響很大：柱堵塞、柱沾污、柱接頭漏液等，都會影響泵的壓力波動、使流速不穩(wěn)定，會影響系統(tǒng)不穩(wěn)，使RSD變壞、峰拖尾、靈敏度降低;

③柱對檢測器影響很大：柱效降低(柱塔板數(shù)降低)、柱堵塞、柱的新舊程度、接頭、管道漏液等，都會影響檢測器的檢測限、分辨率、噪聲、和靈敏度。

但是，色譜柱是易損件，用戶會經(jīng)常在色譜柱長時(shí)間使用后換新柱，此時(shí)HPLC系統(tǒng)的泵和檢測器基本進(jìn)入“電子元件失效理論”的盆底，比較穩(wěn)定了。所以，不會因?yàn)閾Q新柱而產(chǎn)生儀器不能使用的問題。特別應(yīng)該指出的是：用戶換新柱后，一般不檢測系統(tǒng)的綜合指標(biāo)。如果檢測指標(biāo)，可能就不能達(dá)到原出廠指標(biāo)(因?yàn)楸煤蜋z測器經(jīng)過較長期使用后，質(zhì)量會有所下降，舊泵、新柱、舊檢測器三者不能達(dá)到最佳配備)，但是不會影響使用。

用戶換新柱不會影響使用的問題，可以從計(jì)量認(rèn)證標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范(JJG)得到佐證。JJG檢驗(yàn)的儀器，很多是在用儀器，它明確規(guī)定被檢儀器的指標(biāo)可以比新出廠的儀器指標(biāo)低，甚至有些指標(biāo)因?yàn)檫_(dá)不到要求而免檢。但我們的制造企業(yè)，在儀器出廠前，必須檢測系統(tǒng)的指標(biāo)，只有系統(tǒng)指標(biāo)達(dá)到設(shè)計(jì)要求時(shí)，才算合格，才能出廠。至于用戶換新檢測器、換新泵、同樣都是允許的。

④檢測器更是直接影響分析測試數(shù)據(jù)可靠性的關(guān)鍵部件之一，研發(fā)者、生產(chǎn)者、使用者都必須高度重視之，才能得到優(yōu)質(zhì)的HPLC系統(tǒng)。

核殼柱是新型色譜柱，是HPLC技術(shù)的最重大的突破。

如前所述，核殼柱有很多優(yōu)點(diǎn)或特點(diǎn)，它是保證高分離效率、保證HPLC高靈敏度、保證高速度的關(guān)鍵所在。并且，它有很多潛力可挖。所以，我們應(yīng)該花大力氣去研究核殼柱及新型的色譜柱。