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2025年1月，韓國科學(xué)技術(shù)院的 Hyun Jung Chung教授和韓國蔚山大學(xué)的Yong Pil Chong教授研究團隊在期刊《Nature Communication》發(fā)表題為：Effective treatment of systemic candidiasis by synergistic targeting of cell wall synthesis的高水平研究論文，成功確定了一個先導(dǎo)物（FTNx），它更傾向于在真菌細胞中積累，并導(dǎo)致顯著的抗真菌作用體外效應(yīng)，這一策略有望成為治療哺乳動物宿主真菌感染的有效方法。

真菌感染對全球人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅，免疫抑制治療、醫(yī)療植入和移植的增加進一步加劇了這一問題。當(dāng)前抗真菌藥物選擇有限，且多藥耐藥性的出現(xiàn)進一步限制了治療。因此，迫切需要確定治療靶點并開發(fā)新型抗真菌藥物。該研究假設(shè)，通過雙重靶向真菌細胞壁合成的關(guān)鍵調(diào)控基因（編碼β-1,3-葡聚糖合成酶的FKS1和編碼幾丁質(zhì)合成酶的CHS3）可協(xié)同抑制真菌生長。通過迭代設(shè)計，他們構(gòu)建了一個小型真菌靶向納米結(jié)構(gòu)庫，并鑒定出一種先導(dǎo)納米結(jié)構(gòu)（FTNx），其在真菌細胞中的積累顯著高于哺乳動物細胞，并在體外表現(xiàn)出顯著的抗真菌效果。進一步研究表明，F(xiàn)TNx在播散性念珠菌病小鼠模型中具有高效性，顯著抑制真菌生長并提高生存率。因此，當(dāng)前策略為靶向人類真菌病原體并解決抗真菌耐藥性挑戰(zhàn)提供了一種強效替代治療方案。

主要內(nèi)容

1、真菌遞送納米結(jié)構(gòu)庫的構(gòu)建

通過雙重靶向抑制真菌細胞壁基本成分：β-1,3-葡聚糖和幾丁質(zhì)的生物合成，可能產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)從而實現(xiàn)念珠菌感染的有效治療。這兩種關(guān)鍵細胞壁成分分別由FKS1和CHS3基因編碼的合成酶調(diào)控。鑒于目前缺乏具有可接受安全性的雙靶點小分子藥物，他們采用不同的真菌靶向反義寡核苷酸（fso）來抑制細胞壁合成基因。為實現(xiàn)真菌細胞特異性靶向，他們構(gòu)建了一個用于fso遞送的靶向納米結(jié)構(gòu)小型庫。該納米結(jié)構(gòu)由三部分組成：陽離子聚合物修飾的金納米顆粒核心 （NPs）、可凝聚核酸并與真菌細胞壁相互作用的帶電陽離子聚合物（X）、以及靶向FKS1和CHS3的雙基因fso（圖1）。

圖一 抗真菌治療設(shè)計及實驗方法概述

次級陽離子聚合物是賦予配方正電荷的必要條件，通常用于促進細胞攝取。他們探索并測試了多種次級陽離子聚合物，如殼聚糖（CS）、聚乙烯亞胺（PEI）、聚烯丙胺（PAA）、聚酰胺胺（PAM）以及單體陽離子精胺（SPN）和魚精蛋白（PTN）（圖2a）。動態(tài)光散射（DLS）測量顯示，納米結(jié)構(gòu)的流體動力學(xué)直徑范圍約為48 nm至158 nm，具體取決于陽離子（X）（圖2b）。其中，CS形成的顆粒尺寸大于130 nm，而PEI、PAA和PTN形成的顆粒較�。�<100 nm）。PAM的尺寸因分子量不同而變化，而SPN形成中等大小的顆粒。低分子量（5 kDa，CSlow）和高分子量（190–310 kDa，CShigh）的CS表現(xiàn)出最低的多分散指數(shù)（PDI），分別為0.19和0.17。根據(jù)Zeta電位測量，使用支鏈和線性PEI（BPEI和LPEI）、CS、PAA和SPN制備的納米結(jié)構(gòu)具有正電荷，范圍從+19.3 mV至+68.4 mV，而使用PAM制備的顆粒則帶負電，范圍為-31.9 mV至-43.5 mV（圖2c）。

為探索真菌靶向性，我們進行了顯微鏡實驗，將熒光素標(biāo)記的fso與不同Nx(X)制劑組成納米結(jié)構(gòu)，并將其與白念珠菌和哺乳動物NIH-3T3）細胞共孵育。在真菌中，我們觀察到兩種不同的染色模式：（i）優(yōu)先細胞壁染色（BPEI、LPEI、PAA、PAM、SPN和PTN）或（ii）真菌細胞質(zhì)中的點狀模式（CS_low、CS_med、CS_high）。由于他們主要關(guān)注fso遞送至真菌細胞內(nèi)部，因此重點關(guān)注表現(xiàn)出點狀細胞內(nèi)染色模式的配方。其中，使用CSlow制備的配方顯示出最高的真菌攝取能力（圖2d）。CSlow觀察到的點狀模式表明，內(nèi)化是通過內(nèi)吞作用發(fā)生的，并導(dǎo)致真菌細胞內(nèi)形成內(nèi)體。體外釋放實驗顯示，CS_low形成的納米結(jié)構(gòu)在3小時內(nèi)實現(xiàn)了83%的fso累積釋放。

圖二 用于真菌靶向的fso納米結(jié)構(gòu)的開發(fā)

2、FTNx的優(yōu)化與真菌遞送

他們通過進一步優(yōu)化和表征實驗驗證了FTNx平臺。DLS測量顯示，NP的尺寸為54 nm，加入fso后增至106 nm，加入CS_low后進一步增至143 nm。Zeta電位在加入fso后從+4.1 mV降至-9.4 mV，隨后加入CSlow后增至+37.0 mV。透射電子顯微鏡觀察顯示，最終制備的FTNx平均直徑約為150 nm，呈現(xiàn)為均勻顆粒。長期穩(wěn)定性測試表明，F(xiàn)TNx配方在7天內(nèi)保持穩(wěn)定。

3、FTNx的體外抗真菌效果

他們測試了FTNx在體外通過沉默細胞壁合成基因（FKS1和CHS3）誘導(dǎo)抗真菌效果的能力。結(jié)果顯示，F(xiàn)TNx顯著降低了FKS1和CHS3的mRNA表達水平（圖3b, c）。雙重靶向FKS1和CHS3的fso通過FTNx遞送表現(xiàn)出協(xié)同抗真菌效果（圖3d-g）。活/死細胞染色和電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TNx顯著降低了葡聚糖和幾丁質(zhì)的合成水平，進一步證實了FTNx的殺菌效果（圖3h-j）。

圖三 雙基因靶向細胞壁合成的抗真菌策略

4、多物種念珠菌的廣譜靶向

白念珠菌是人類最常見的真菌物種，但熱帶念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌 、克柔念珠菌和耳念珠菌的感染也較為顯著。因此，他們致力于設(shè)計靶向這些物種FKS1、FKS2和CHS3基因保守區(qū)域的候選fso序列（圖4a）。其中，靶向FKS1的F.57-58和靶向FKS2的C.82-83顯示出最強的抗真菌效果（圖4b）。隨后我們評估了FTNx遞送雙fso組合的抗真菌效應(yīng)。雖然部分通用設(shè)計的fso效果低于白念珠菌特異性fso，但靶向FKS1的F.48、F.57-58和靶向CHS3的C.57表現(xiàn)出卓越的抗真菌活性（圖4c）。時序監(jiān)測顯示，采用通用設(shè)計候選組合F.48+C.57的雙fso遞送方案，在處理后6小時即可觀察到顯著效果，并持續(xù)至24小時（圖4d）。增加FTNx濃度可增強抗真菌效應(yīng)（圖4e）。接下來他們在熱帶念珠菌、光滑念珠菌和克柔念珠菌中測試了fso F.48+C.57的組合，證實FTNx能高效遞送，而裸露fso則無法實現(xiàn)（圖4f）。用FTNx遞送通用fso處理五種念珠菌屬的七種菌株后，所有菌株均表現(xiàn)出顯著抗真菌效果（圖4g）。這些結(jié)果表明FTNx平臺可通過針對各靶基因的通用fso，靈活應(yīng)用于多種致病念珠菌。該平臺還有潛力拓展至其他致病真菌，如隱球菌、馬拉色菌等酵母樣真菌，以及曲霉等與念珠菌具有相似細胞壁結(jié)構(gòu)的絲狀真菌。為優(yōu)化體內(nèi)驗證效果，他們研究了采用gapmer平臺。gapmer平臺設(shè)計采用硫代磷酸酯DNA作為骨架，在兩端加入 2′-O-甲基化修飾的 RNA進行基因沉默。體外實驗顯示，在米卡芬凈存在下，針對FKS1的gapmer版fso候選物大多數(shù)優(yōu)于未修飾的fso， 其中F.54和F.57抗真菌活性最強（圖4h）。

圖四 針對多種念珠菌的通用fso的開發(fā)和驗證

5、FTNx在小鼠模型中的體內(nèi)療效

為進一步評估FTNx構(gòu)建體的藥代動力學(xué)和藥效學(xué)特征，他們在小鼠模型進行了一系列研究。首先通過熒光成像觀察了未感染小鼠體內(nèi)FTNx的分布情況（圖5a）。注射6小時后，F(xiàn)TNx組在腎臟、肝臟和肺組織中顯示出顯著高于裸露fso的熒光信號（圖5b,c）。隨后他們在環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)免疫抑制的全身性念珠菌病模型（模擬臨床常見情況）中評估了FTNx療效（圖5d）。通過測定不同劑量下腎臟菌落形成單位（CFU），發(fā)現(xiàn)1X劑量的雙fso（F.Ca + C.Ca）FTNx可完全抑制真菌生長，而搭載非靶向fso（NT）的FTNx則無顯著效果（圖5e,f）。同事，他們也測試了搭載gapmer修飾雙fso（包含通用設(shè)計fso）的FTNx作為潛在廣譜抗念珠菌療法的效果。結(jié)果顯示FTNx（F.57 + C.Ca）能徹底清除感染，而NT對照組無效（圖5g）。腎臟組織的過碘酸雪夫（PAS）和蘇木精-伊紅（H&E）染色也證實了FTNx（F.57 + C.Ca）的顯著抗真菌作用（圖5h）。值得注意的是，即使在感染后6小時才開始治療，F(xiàn)TNx組仍檢測不到真菌負荷，這凸顯了該平臺在延遲給藥條件下的治療潛力。最令人矚目的是生存率結(jié)果：在致死性念珠菌病模型中，F(xiàn)TNx組實現(xiàn)100%存活（圖5i）。FTNx治療組小鼠平均體重保持穩(wěn)定（圖5j）。在皮膚念珠菌病模型中，F(xiàn)TNx同樣表現(xiàn)出顯著的真菌抑制和輕微炎癥反應(yīng)（圖5k-m），而PBS對照組則出現(xiàn)嚴(yán)重的假菌絲形成和炎癥征象。通過檢測血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）和血尿素氮（BUN）水平（ALT 28-132 U/L，BUN 18-29 mg/dL）證實FTNx體內(nèi)毒性可控（圖5n,o）。

圖五 FTNx體內(nèi)抗真菌效果

結(jié)論

這些研究結(jié)果表明，F(xiàn)TNx能高效選擇性遞送靶向FKS1和CHS3基因的fso，實現(xiàn)雙重基因沉默從而破壞病原體細胞壁合成，從而產(chǎn)生顯著抗真菌效果。而且FTNx能在體內(nèi)完全抑制真菌生長并緩解念珠菌病，且?guī)缀醪划a(chǎn)生毒性。需要指出的是，該平臺在壞死組織（存在血管分布不足、缺氧和酸性環(huán)境）中的遞送效率可能面臨挑戰(zhàn)，未來需探索克服這些障礙的策略。特別是，諸如耳念珠菌等病原體已對傳統(tǒng)抗真菌藥物表現(xiàn)出高度耐藥性，這表明本平臺可提供替代治療方案。通過對納米結(jié)構(gòu)平臺的進一步改造，有望實現(xiàn)針對其他病原體（如難治性絲狀真菌）的靶向遞送。這一策略為念珠菌感染的管理提供了有前景的替代治療方案。