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發(fā)表年：2025年
雜志：Nature Food
中文標(biāo)題：基于磁珠輔助成像轉(zhuǎn)碼系統(tǒng)的Argonaute介導(dǎo)的數(shù)字傳感器用于多重食源性病原體檢測(cè)
原英文標(biāo)題：

Multiplexed food-borne pathogen detection using an argonaute-mediated digital sensor based on a magnetic-bead-assisted imaging transcoding system

原文鏈接DOI：

https://doi.org/10.1038/s43016-024-01082-y

摘要

食源性疾病每年導(dǎo)致6億人患病和42萬(wàn)人死亡，世界衛(wèi)生組織將其列為全球公共衛(wèi)生的主要威脅之一。傳統(tǒng)的病原體檢測(cè)方法如微生物培養(yǎng)、免疫分析和PCR技術(shù)雖然可靠，但存在耗時(shí)長(zhǎng)、靈敏度低或易受污染等問(wèn)題。本文提出了一種基于**Clostridium butyricum Argonaute（CbAgo）和磁珠（MBs）**的數(shù)字核酸檢測(cè)平臺(tái)（d-MAGIC），能夠在不進(jìn)行DNA擴(kuò)增的情況下，實(shí)現(xiàn)多重、超靈敏的食源性病原體檢測(cè)。該平臺(tái)利用CbAgo的雙向?qū)б�精確切割活性，通過(guò)兩步反應(yīng)切割熒光-淬滅報(bào)告分子，并結(jié)合熒光編碼的磁珠作為多探針，實(shí)現(xiàn)了多重病原體的同時(shí)檢測(cè)。通過(guò)人工智能（AI）算法“Panda”對(duì)熒光圖像進(jìn)行解碼，d-MAGIC平臺(tái)在10^1到10^7 CFU/ml的范圍內(nèi)表現(xiàn)出廣泛的檢測(cè)能力，檢測(cè)限低至6 CFU/ml。該方法簡(jiǎn)化了傳統(tǒng)數(shù)字檢測(cè)的復(fù)雜流程，展示了在食品安全領(lǐng)域的巨大應(yīng)用潛力。

研究背景

食源性疾病是全球公共衛(wèi)生的重大挑戰(zhàn)，每年導(dǎo)致數(shù)百萬(wàn)人患病和數(shù)十萬(wàn)人死亡。常見(jiàn)的食源性病原體包括沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和單核細(xì)胞增生李斯特菌等，它們廣泛存在于各種食品和環(huán)境樣本中，可能引發(fā)嚴(yán)重的健康問(wèn)題，如腸道炎癥、腹瀉、嘔吐、慢性腎病甚至死亡。因此，開(kāi)發(fā)快速、靈敏且多重的病原體檢測(cè)方法對(duì)于預(yù)防和控制食源性疾病的爆發(fā)至關(guān)重要。

傳統(tǒng)的病原體檢測(cè)方法主要包括微生物培養(yǎng)、免疫分析和PCR技術(shù)。微生物培養(yǎng)雖然可靠，但耗時(shí)長(zhǎng)，通常需要數(shù)天才能得到結(jié)果。免疫分析雖然快速，但靈敏度較低，且需要昂貴的抗體。PCR技術(shù)（包括實(shí)時(shí)定量PCR）因其高靈敏度和準(zhǔn)確性被視為金標(biāo)準(zhǔn)，但其DNA擴(kuò)增步驟容易受到環(huán)境氣溶膠的污染，導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。近年來(lái)，基于CRISPR-Cas系統(tǒng)的數(shù)字液滴PCR（ddPCR）技術(shù)因其超靈敏性和準(zhǔn)確性在核酸檢測(cè)中嶄露頭角，但其多重檢測(cè)能力有限，且需要復(fù)雜的微流控芯片和設(shè)備。

為了克服這些局限性，本文提出了一種基于Argonaute（Ago）蛋白和**磁珠（MBs）**的新型數(shù)字核酸檢測(cè)平臺(tái)（d-MAGIC）。Argonaute是一類由核酸引導(dǎo)的內(nèi)切酶，具有高度的特異性，能夠在室溫下進(jìn)行DNA切割。與CRISPR-Cas系統(tǒng)不同，CbAgo能夠在無(wú)需DNA擴(kuò)增的情況下，通過(guò)兩步反應(yīng)精確切割目標(biāo)DNA，并生成新的引導(dǎo)鏈用于進(jìn)一步的特異性切割。此外，磁珠作為信號(hào)載體，能夠通過(guò)熒光編碼實(shí)現(xiàn)多重檢測(cè)，并通過(guò)AI算法對(duì)熒光圖像進(jìn)行解碼，簡(jiǎn)化了傳統(tǒng)數(shù)字檢測(cè)的復(fù)雜流程。

d-MAGIC平臺(tái)的創(chuàng)新之處在于：（1）結(jié)合了CbAgo的精確切割能力和磁珠的熒光編碼技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了無(wú)需DNA擴(kuò)增的多重、超靈敏檢測(cè)；（2）利用微米級(jí)磁珠作為數(shù)字化和編碼載體，簡(jiǎn)化了傳統(tǒng)液滴數(shù)字化的方法，并具有抗干擾能力；（3）通過(guò)AI算法優(yōu)化了檢測(cè)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了高效的熒光圖像解碼和定量信號(hào)分析。該平臺(tái)在食品安全領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景，能夠快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)食品中的多重病原體，為食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供了強(qiáng)有力的工具。

研究圖文詳解

圖1：

圖1a：展示了針對(duì)三種食源性病原體（沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和單核細(xì)胞增生李斯特菌）設(shè)計(jì)的特異性引導(dǎo)DNA（gDNA），并通過(guò)CbAgo進(jìn)行兩步切割反應(yīng)。

圖1b：描述了磁珠-酪胺-鏈霉親和素（MB-TA-SA）復(fù)合物的制備過(guò)程，以及熒光編碼的實(shí)現(xiàn)。

圖1c：展示了熒光編碼磁珠的成像和AI解碼過(guò)程，通過(guò)CLSM獲取熒光圖像，并通過(guò)AI算法進(jìn)行解碼和定量分析。

圖2：

圖2a：展示了CbAgo的兩步切割機(jī)制，通過(guò)初級(jí)切割生成的短DNA片段作為新的引導(dǎo)鏈進(jìn)行次級(jí)切割。

圖2b-2k：通過(guò)MALDI-TOF/TOF、凝膠電泳、圓二色光譜等技術(shù)對(duì)CbAgo和MB-TA-SA復(fù)合物進(jìn)行了表征，驗(yàn)證了其結(jié)構(gòu)和功能。

圖3：

圖3a：展示了熒光編碼磁珠的成像過(guò)程和AI解碼算法“Panda”的工作流程。

圖3b-3d：比較了AI解碼、手動(dòng)計(jì)數(shù)和ImageJ軟件的計(jì)數(shù)結(jié)果，驗(yàn)證了AI解碼的準(zhǔn)確性和一致性。

圖4：

圖4a-4d：展示了d-MAGIC平臺(tái)對(duì)單一食源性病原體的檢測(cè)能力，檢測(cè)范圍從10^1到10^7 CFU/ml，檢測(cè)限低至6 CFU/ml。

圖4e-4j：驗(yàn)證了d-MAGIC平臺(tái)的特異性和抗干擾能力，表明其在復(fù)雜樣本中仍能保持高靈敏度和準(zhǔn)確性。

圖5：

圖5a-5d：展示了d-MAGIC平臺(tái)對(duì)三種食源性病原體的多重檢測(cè)能力，檢測(cè)范圍與單一檢測(cè)一致，且回收率在91%到113%之間，表明其在復(fù)雜樣本中的優(yōu)異表現(xiàn)。

圖6：

圖6a-6e：通過(guò)實(shí)際食品樣本（如蝦、雞蛋和雞肉）的檢測(cè)，驗(yàn)證了d-MAGIC平臺(tái)在實(shí)際應(yīng)用中的準(zhǔn)確性和可靠性，并與qPCR方法進(jìn)行了對(duì)比，結(jié)果顯示兩者具有良好的一致性。

總結(jié)和展望

本文提出的d-MAGIC平臺(tái)代表了食源性病原體檢測(cè)領(lǐng)域的一項(xiàng)重大突破。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法如微生物培養(yǎng)、免疫分析和PCR技術(shù)雖然各有優(yōu)勢(shì)，但都存在一定的局限性。微生物培養(yǎng)雖然可靠，但耗時(shí)長(zhǎng)；免疫分析雖然快速，但靈敏度較低；PCR技術(shù)雖然靈敏，但易受污染且需要復(fù)雜的DNA擴(kuò)增步驟。d-MAGIC平臺(tái)通過(guò)結(jié)合CbAgo的精確切割能力、磁珠的熒光編碼技術(shù)和AI算法的圖像解碼，成功實(shí)現(xiàn)了無(wú)需DNA擴(kuò)增的多重、超靈敏檢測(cè)，極大地簡(jiǎn)化了檢測(cè)流程，并提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。

d-MAGIC平臺(tái)的創(chuàng)新之處在于其多重檢測(cè)能力和抗干擾性能。通過(guò)CbAgo的兩步切割反應(yīng)，平臺(tái)能夠精確切割目標(biāo)DNA，并生成新的引導(dǎo)鏈用于進(jìn)一步的特異性切割。這種機(jī)制不僅提高了檢測(cè)的特異性，還避免了傳統(tǒng)CRISPR-Cas系統(tǒng)的非特異性切割問(wèn)題。此外，磁珠作為信號(hào)載體，能夠通過(guò)熒光編碼實(shí)現(xiàn)多重檢測(cè)，并通過(guò)AI算法對(duì)熒光圖像進(jìn)行解碼，簡(jiǎn)化了傳統(tǒng)數(shù)字檢測(cè)的復(fù)雜流程。AI算法“Panda”不僅能夠準(zhǔn)確分類、分級(jí)和計(jì)數(shù)磁珠，還能根據(jù)熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量分析，進(jìn)一步提高了檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性。

在實(shí)際應(yīng)用中，d-MAGIC平臺(tái)展示了廣泛的檢測(cè)范圍和低至6 CFU/ml的檢測(cè)限，能夠快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)食品中的多重病原體。通過(guò)對(duì)實(shí)際食品樣本（如蝦、雞蛋和雞肉）的檢測(cè)，d-MAGIC平臺(tái)與qPCR方法的結(jié)果具有良好的一致性，表明其在食品安全領(lǐng)域的巨大應(yīng)用潛力。此外，d-MAGIC平臺(tái)在復(fù)雜樣本中的優(yōu)異表現(xiàn)，進(jìn)一步證明了其在食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中的可靠性。

展望未來(lái)，d-MAGIC平臺(tái)的應(yīng)用前景不僅限于食品安全領(lǐng)域，還可以擴(kuò)展到臨床核酸檢測(cè)、環(huán)境監(jiān)測(cè)等多個(gè)領(lǐng)域。隨著AI技術(shù)的不斷發(fā)展，d-MAGIC平臺(tái)的解碼算法有望進(jìn)一步優(yōu)化，提高檢測(cè)的效率和準(zhǔn)確性。此外，未來(lái)的研究可以探索將d-MAGIC平臺(tái)與便攜式設(shè)備結(jié)合，實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，為食品安全和公共衛(wèi)生提供更加便捷的解決方案。

總之，d-MAGIC平臺(tái)通過(guò)結(jié)合CbAgo的精確切割能力、磁珠的熒光編碼技術(shù)和AI算法的圖像解碼，成功實(shí)現(xiàn)了無(wú)需DNA擴(kuò)增的多重、超靈敏檢測(cè)，為食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供了強(qiáng)有力的工具。隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，d-MAGIC平臺(tái)有望在食品安全、臨床診斷和環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用，為全球公共衛(wèi)生安全做出重要貢獻(xiàn)。