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2024年11月4日，國際化學(xué)類頂級期刊《德國應(yīng)用化學(xué)國際版》（Angewandte Chemie-international Edition）（IF 16.1）上發(fā)表了題為《LAMP-MS for Locus-Specific Visual Quantification of DNA 5mC and RNA m6A Using Ultra-Low Input》的研究論文。該工作由復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院胡璐璐研究員團(tuán)隊、華山醫(yī)院消化科劉杰主任團(tuán)隊、美國芝加哥大學(xué)何川院士團(tuán)隊攜手柏锘（上海）醫(yī)療科技有限公司共同完成。
LAMP-MS的完整工作流程：
從血漿中提取1ng的cfDNA樣本，經(jīng)過末端修復(fù)后，用含有甲基化雙鏈T7啟動子的DNA接頭進(jìn)行連接。在亞硫酸氫鹽處理后，非甲基化的胞嘧啶（dC）轉(zhuǎn)化為尿嘧啶（dU），而甲基化的胞嘧啶（5mC）保持不變。使用T7 RNA聚合酶進(jìn)行無偏好性線性擴(kuò)增，產(chǎn)生微克數(shù)量級的RNA產(chǎn)物。隨后的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生同樣是微克水平的cDNA。通過序列特異性PCR對含有特定DNA甲基化位點的DNA片段進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增。對特定的DNA片段進(jìn)行文庫構(gòu)建和淺測序，稱為靶向LAMP-Seq。利用位點特異性引物進(jìn)行單堿基延伸，如果延伸位點進(jìn)入的是ddATP，代表此處為未甲基化的C，如果是ddGTP則代表甲基化的5mC，通過這種方法判斷待檢測位點是否甲基化。根據(jù)核酸質(zhì)譜圖上峰的位置，計算出ddG/ddA，即5mC/C。
為驗證LAMP-MS方法的性能，研究團(tuán)隊合成了含有0%、5%、10%、25%、50%、75%及100% 5mC的一系列DNA探針，利用1ng的上述探針對LAMP-MS方法進(jìn)行了測試，發(fā)現(xiàn)即使是5%的甲基化含量，該方法也可以實現(xiàn)靈敏地檢測（圖2A），標(biāo)定曲線也表明檢測準(zhǔn)確性和理論值高度吻合（圖2B）。
圖3 在結(jié)直腸癌和非結(jié)直腸癌患者中驗證LAMP-MS方法
研究團(tuán)隊認(rèn)為，同樣的策略也可以拓展到RNA的定量檢測中，例如在大多數(shù)高等生物mRNA中含量最豐富、并且對于生命過程起著重要調(diào)節(jié)作用的m6A修飾的檢測。研究團(tuán)隊將已發(fā)表的GLORI技術(shù)和核酸質(zhì)譜有機(jī)整合成為m6A核酸質(zhì)譜方法。該方法從HELA細(xì)胞中提取mRNA，將未甲基化的腺嘌呤轉(zhuǎn)化為肌苷，保留甲基化的m6A。經(jīng)過末端修復(fù)、加接頭，再將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，作為模板進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增，然后通過核酸質(zhì)譜單堿基延伸，加入ddATP代表檢測位點對應(yīng)m6A，ddGTP對應(yīng)未甲基化的腺嘌呤。對比HELA細(xì)胞mRNA中RXRA基因（100% m6A），TNFRSF10B基因（100% m6A）和FBXL19基因（53% m6A），及其各自鄰近的非甲基化腺嘌呤位點，證明該m6A核酸質(zhì)譜方法能夠進(jìn)行有效地RNA甲基化定量檢測（圖4）。
該研究表明，LAMP-MS（及m6A核酸質(zhì)譜方法）可以實現(xiàn)超低量樣本的甲基化檢測，且結(jié)果可以直接可視化，不需要高通量測序繁復(fù)的數(shù)據(jù)分析處理過程，因此有潛力作為表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域重要的實用工具，為科研工作者的實驗室研究和臨床樣本檢測提供了廣闊的應(yīng)用前景。
論文原文：
Lulu Hu, Runyu Xie, Xiaotong Yang, Weizhi He, Zhongguang Luo, Wenshuai Li, Chu Xu, Xiaolong Cui, Ning Wei, Xiaolan Wang, Yixiang Shi, Chuan He, Jie Liu, Wei Zhang. LAMP-MS for Locus-Specific Visual Quantification of DNA 5mC and RNA m6A Using Ultra-Low Input. Angew. Chem. Int. Ed. 2024, e202413872.
鏈接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202405186
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