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引言

核糖體在基因表達調控中十分重要，尤其是通過核糖體相關蛋白（RAPs）來調控翻譯。RAPs在神經發(fā)育和免疫反應等許多生物過程中發(fā)揮重要作用，但由于缺乏有效的識別不同組織和細胞類型中的 RAP 的方法，難以對它們進行深入研究。常見的研究方法具有缺乏特異性、依賴遺傳編輯和處理步驟繁瑣的缺陷：密度或大小分離法，通過密度或大小對細胞裂解物進行分級，缺乏特異性^【1】；Ribo-FLAG免疫沉淀（IP）法，則依賴于核糖體核心蛋白（RPs）上標記FLAG標簽的遺傳標記，無法在組織或患者樣本中應用^【2】；活性核糖體捕獲-MS（ARC-MS）是一種使用Click化學來分離核糖體和RAPs的新化學方法，需要樣本處理（如使用疊氮基高代氨酸），并且傾向于識別翻譯早期階段的核糖體，導致樣本偏向^【3】。

近日，斯坦福大學的Maria Barna和UCSF的Davide Ruggero團隊合作在Molecular Cell上在線發(fā)表了題為RAPIDASH: Tag-free enrichment of ribosome associated proteins reveals composition dynamics in embryonic tissue, cancer cells, and macrophages的文章，開發(fā)了一種叫做RAPIDASH的RAPs富集方法，能夠跨越多種樣本類型和環(huán)境，富集并分析核糖體相關蛋白的組成動態(tài)。

RAPIDASH方法用一種帶有巰基的硫鍵樹脂，通過與核糖體RNA的特異性結合，富集核糖體及其相關的蛋白質。RAPIDASH顯著富集了核糖體蛋白，較以往的超速離心方法，RAPIDASH顯現出更高的特異性和有效性，能夠識別大多數核糖體蛋白及相關的翻譯因子。

圖1：RAPIDASH流程示意圖：細胞質裂解物經過蔗糖墊超速離心和巰基樹脂層析，富集含有RNA的高分子量復合物（Credit: Molecular Cell）

研究團隊使用這種方法處理了多種生物樣本，包括小鼠胚胎組織、癌細胞和受刺激的巨噬細胞，并通過質譜分析（MS）鑒定富集的蛋白質，研究RAPs的動態(tài)變化。

他們將RAPIDASH技術應用于小鼠E12.5階段的胚胎組織，包括前腦、肢體和肝臟，富集并分析這些組織中的RAPs，發(fā)現前腦中特異性富集的RAPs（如Dhx30和LLPH）可能與神經發(fā)育相關，例如，LLPH在長mRNA轉錄本的翻譯中起關鍵作用，這對神經系統(tǒng)的發(fā)育至關重要。

為了探索核糖體組成如何在腫瘤進展中發(fā)生變化，他們將RAPIDASH技術應用于前列腺癌細胞系PC3，分析在抑制mTOR信號通路前后，核糖體及其相關蛋白的變化。通過質譜分析鑒定核糖體相關蛋白的變化，發(fā)現在抑制mTOR信號后，eIF4G1等翻譯起始因子與核糖體的結合減少，這表明mTOR信號通路調控了特定RAPs的翻譯功能。

他們還探究了巨噬細胞在免疫激活后的RAP重構，通過RAPIDASH技術富集巨噬細胞在TLR3和TLR4免疫激活后不同時間點的核糖體，分析其組成的動態(tài)變化，發(fā)現免疫激活后，許多參與抗病毒反應的RAPs如IFIT家族蛋白顯著富集。這一結果表明，核糖體不僅是蛋白合成的機器，還參與了免疫反應的調控。

綜上所述，這個研究驗證了RAPIDASH技術在小鼠胚胎干細胞中的應用，并將這個技術應用于組織特異性功能中。同時癌細胞和免疫細胞中的實驗展示了RAPIDASH技術能揭示癌癥和免疫反應中核糖體的動態(tài)變化。

模式圖（Credit: Molecular Cell）

參考文獻

1. Mehta, P., Woo, P., Venkataraman, K., and Karzai, A.W. (2012). Ribosome purification approaches for studying interactions of regulatory proteins and RNAs with the ribosome. Methods Mol. Biol. 905, 273–289. https://doi.org/10.1007/978-1-61779-949-5_18.

2. Simsek, D., Tiu, G.C., Flynn, R.A., Byeon, G.W., Leppek, K., Xu, A.F., Chang, H.Y., and Barna, M. (2017). The mammalian ribo-interactome reveals ribosome functional diversity and heterogeneity. Cell 169, 1051– 1065.e18. https://doi.org/10.1016/j.cell.2017.05.022

3. Bartsch, D., Kalamkar, K., Ahuja, G., Lackmann, J.-W., Hescheler, J., Weber, T., Bazzi, H., Clamer, M., Mendjan, S., Papantonis, A., et al. (2023). mRNA translational specialization by RBPMS presets the competence for cardiac commitment in hESCs. Sci. Adv. 9, eade1792. https://doi.org/10.1126/sciadv.ade1792.

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2024.08.023