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2024 年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)聯(lián)合授予了維克多·安布羅斯（Victor Ambros）和加里·魯夫昆（Gary Ruvkun），以表彰他們發(fā)現(xiàn)了微小 RNA（microRNA）及其在轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控中的作用。
微RNA及其在轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控中的作用
當(dāng)多細(xì)胞生物從單細(xì)胞生物祖先演化而來(lái)時(shí)，其體內(nèi)的每種細(xì)胞類(lèi)型都獲得了特定功能，故而需要愈發(fā)復(fù)雜的基因調(diào)控機(jī)制。除了由作用于調(diào)控序列的 DNA 結(jié)合因子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄水平的基因調(diào)控之外，隨著復(fù)雜生物的演化，其他形式的控制系統(tǒng)也逐步出現(xiàn)。在漫長(zhǎng)的數(shù)億年時(shí)間里，編碼微 RNA 的基因在多細(xì)胞生物的基因組中不斷發(fā)展，以便在 mRNA 穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)翻譯水平上發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用。
然而，直到 1993 年，維克托・安布羅斯和加里・魯夫昆發(fā)現(xiàn)了微 RNA 及其基因調(diào)控方式，這些情況才得以被完全知曉。2024 年的兩位諾貝爾獎(jiǎng)得主對(duì)因 lin - 4 和 lin - 14 遺傳位點(diǎn)變異而出現(xiàn)發(fā)育缺陷的突變秀麗隱桿線蟲(chóng)進(jìn)行了研究：安布羅斯的實(shí)驗(yàn)室克隆了 lin - 4 基因，卻驚訝地發(fā)現(xiàn)它并不編碼蛋白質(zhì)，而是編碼一個(gè)由 22 個(gè)核苷酸組成的非編碼 RNA。與此同時(shí)，魯夫昆實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn) lin - 4 通過(guò) lin - 14 的 3' 非翻譯區(qū)（3'-UTR）中的多個(gè)元件對(duì) lin - 14（一種核蛋白）進(jìn)行調(diào)控。
通過(guò)對(duì)比序列信息，他們發(fā)現(xiàn)短鏈非編碼 RNA lin - 4 與 lin - 14 對(duì)應(yīng)基因的 3'-UTR 元件之間存在部分序列互補(bǔ)性。這首次揭示出一種在概念上全新的調(diào)控 RNA 類(lèi)型 —— 微 RNA。2000 年，魯夫昆實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)了高度保守的 let - 7 微 RNA，隨后科學(xué)家們?cè)诎ㄈ祟?lèi)在內(nèi)的多種動(dòng)物中進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了同源的微 RNA。這一發(fā)現(xiàn)引發(fā)了動(dòng)物界對(duì)微 RNA 的廣泛克隆和測(cè)序研究，結(jié)果表明微 RNA 涵蓋了一大類(lèi)調(diào)節(jié)元件，控制著龐大的蛋白質(zhì)編碼基因網(wǎng)絡(luò)。
安布羅斯和魯夫昆的發(fā)現(xiàn)完全出乎意料，揭示了一種由微 RNA 介導(dǎo)的、在演化上保守的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制，該機(jī)制在動(dòng)物發(fā)育以及成年生物體的組織功能中起著關(guān)鍵作用。
基因的調(diào)控機(jī)制
生命能夠掌控自身在何時(shí)何地轉(zhuǎn)錄基因、生成 RNA，并將其翻譯為蛋白質(zhì)，這是生物中一個(gè)極為基礎(chǔ)的過(guò)程（圖 1）。比如，胰島素由胰島中的 β 細(xì)胞產(chǎn)生，視蛋白則由視網(wǎng)膜中的細(xì)胞產(chǎn)生。針對(duì)不同細(xì)胞的精確特異性基因調(diào)控指令被編碼在其遺傳物質(zhì)當(dāng)中，并通過(guò)序列特異性的 DNA 結(jié)合蛋白發(fā)揮作用。弗朗索瓦・雅各布和雅克・莫諾因發(fā)現(xiàn)基因的調(diào)控機(jī)制，于 1965 年榮獲諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。在單細(xì)胞和多細(xì)胞真核生物里，DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子高度保守，而在多細(xì)胞生物體內(nèi)則出現(xiàn)了額外的基因調(diào)控層級(jí)，以確保在任何特定時(shí)刻，每種細(xì)胞中都能正確地產(chǎn)生 RNA 和蛋白質(zhì)。
圖 1. 細(xì)胞類(lèi)型特異性的功能調(diào)控。每個(gè)細(xì)胞都包含一套相同的染色體，因此具有完全相同的基因組。細(xì)胞類(lèi)型特異性功能指的是，在每種不同類(lèi)型的細(xì)胞中只有一部分特定的基因被激活。（圖片來(lái)源：諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)委員會(huì)。制圖：Mattias Karlén）
真核生物模型在遺傳研究中有著難以估量的價(jià)值，帶來(lái)了眾多意想不到的發(fā)現(xiàn)。半個(gè)多世紀(jì)以前，悉尼・布倫納將秀麗隱桿線蟲(chóng)引入遺傳學(xué)研究領(lǐng)域。這種生物每一代壽命較短，身體透明，又易于進(jìn)行遺傳操作，故而得到了廣泛研究。布倫納、約翰・薩爾斯頓和羅伯特・霍維茨借助這種線蟲(chóng)，揭示了在器官發(fā)育過(guò)程中，遺傳基因如何控制細(xì)胞分裂、分化和死亡，他們也因此獲得了 2002 年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。
20 世紀(jì) 70 年代，布倫納實(shí)驗(yàn)室通過(guò)對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)進(jìn)行突變篩選，發(fā)現(xiàn)了 lin - 4 突變體（e912）。這些線蟲(chóng)呈現(xiàn)出一些明顯的表型，如許多細(xì)胞類(lèi)型和形態(tài)結(jié)構(gòu)完全缺失，例如因陰門(mén)發(fā)育失敗致使卵子積聚（圖 2），這似乎是由于一些特定細(xì)胞譜系的發(fā)育程序出現(xiàn)重復(fù)而引發(fā)的。
在 lin - 4 線蟲(chóng)突變體中觀察到的顯著發(fā)育中斷表明，lin - 4 編碼了發(fā)育時(shí)序中的一個(gè)主要調(diào)控因子。大量具有不同時(shí)序發(fā)育缺陷的異時(shí)性突變體被鑒定出來(lái)，其中包括霍維茨實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)的第二個(gè)突變體 ——lin - 14 突變體。
與此同時(shí)，安布羅斯彼時(shí)正跟隨戴維・巴爾的摩研究脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組的結(jié)構(gòu)與復(fù)制。在獲得博士學(xué)位后，他加入了霍維茨實(shí)驗(yàn)室。身為博士后研究員，安布羅斯立即展開(kāi)對(duì)異時(shí)性突變體的遺傳分析，并發(fā)現(xiàn) lin - 14 突變體有著與 lin - 4 突變體相反的發(fā)育時(shí)序缺陷（圖 2）。在 lin - 14 突變體中，幼蟲(chóng)程序完全缺失。值得注意的是，安布羅斯后來(lái)發(fā)覺(jué) lin - 4 是 lin - 14 的負(fù)調(diào)控因子。
在此期間，魯夫昆在 Frederick Ausubel 的指導(dǎo)下完成了細(xì)菌遺傳學(xué)博士學(xué)位。在歐洲游歷期間，他學(xué)會(huì)了異時(shí)性突變體的細(xì)胞譜系分析，從而對(duì)線蟲(chóng)遺傳學(xué)開(kāi)始產(chǎn)生濃厚興趣。隨后，他與 Martin Chalfie 和霍維茨進(jìn)行討論，這更進(jìn)一步激發(fā)了他利用秀麗隱桿線蟲(chóng)來(lái)研究這些問(wèn)題的興趣。1982 年，魯夫昆開(kāi)始在 Walter Gilbert 和霍維茨的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行聯(lián)合博士后研究。
發(fā)現(xiàn)微RNA介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控
在霍維茨實(shí)驗(yàn)室中，安布羅斯和魯夫昆開(kāi)啟了他們漫長(zhǎng)的克隆 lin - 14 的征程。那時(shí)，通過(guò)遺傳學(xué)確定基因座的 DNA 序列是一項(xiàng)極為艱巨的任務(wù)。歷經(jīng)多年的實(shí)驗(yàn)，他們成功運(yùn)用經(jīng)典的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性方法確定了該區(qū)域。
在此期間，安布羅斯和魯夫昆都獲得了教職崗位：安布羅斯在美國(guó)哈佛大學(xué)任職，而魯夫昆則在麻省總醫(yī)院和哈佛醫(yī)學(xué)院工作。他們專注于自己的研究問(wèn)題，持續(xù)進(jìn)行分子分析。魯夫昆證實(shí)，lin - 14 是一種在發(fā)育過(guò)程特定階段表達(dá)的核蛋白，在 L1 階段（幼蟲(chóng)的第一階段）表達(dá)量較高，而在 lin - 4 和 lin - 14 發(fā)生突變的個(gè)體中，其表達(dá)量會(huì)發(fā)生改變。有趣的是，研究人員發(fā)現(xiàn)了 lin - 14 的功能獲得突變體，其 3'-UTR 區(qū)域存在缺失，致使 lin - 14 蛋白在 L1 階段之后仍能被檢測(cè)到。3'-UTR 元件的破壞對(duì)蛋白質(zhì)序列并無(wú)影響。因此，魯夫昆推測(cè)，一種作用于 mRNA 穩(wěn)定性、核輸出或翻譯的轉(zhuǎn)錄后機(jī)制或許介導(dǎo)了 lin - 14 的時(shí)間切換。
與 lin - 14 有若干個(gè)突變體不同，科學(xué)家僅發(fā)現(xiàn)了一個(gè) lin - 4 突變體（e912）。安布羅斯實(shí)驗(yàn)室著手通過(guò)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性和 DNA 印跡探針來(lái)克隆 lin - 4 基因。他們沿著染色體序列依次并反復(fù)測(cè)試較小的基因組片段，查看其能否挽救 lin - 4 突變的表型，最終精確定位了一個(gè) 693 個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)的、被 SalI 限制性內(nèi)切酶切下的片段。經(jīng)過(guò)多輪開(kāi)放閱讀框（ORF）預(yù)測(cè)和克隆重測(cè)序后，他們排除了許多錯(cuò)誤選項(xiàng)，隨后開(kāi)始懷疑 lin - 4 基因可能是一個(gè)非編碼 RNA，因?yàn)樗?ORF 序列較短。他們將移碼突變引入秀麗隱桿線蟲(chóng)的基因組中，結(jié)果并未影響 lin - 4 的功能，這證實(shí)了他們的懷疑。1991 年，他們通過(guò) RNA 印跡法和 RNA 酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了 lin - 4 的轉(zhuǎn)錄本，發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)長(zhǎng)度分別為 61 和 22 個(gè)核苷酸的短 RNA 轉(zhuǎn)錄物（圖 3）。
圖 3. 兩種短 lin-4 轉(zhuǎn)錄物的鑒定。RNA 印跡法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，從左至右依次為野生型、lin-4 突變體和用 Sal I 片段挽救的 lin-4 突變體的總 RNA。研究人員用放射性標(biāo)記的 lin-4 RNA 作為探針，并用 U6 作為對(duì)照。（圖片來(lái)源：Lee, Feinbaum 和 Ambros, 1993）。
在分別解析出 lin - 4（安布羅斯實(shí)驗(yàn)室）和 lin - 14（魯夫昆實(shí)驗(yàn)室）的序列后，1992 年 6 月 11 日晚，安布羅斯與魯夫昆交換了 lin - 4 和 lin - 14 基因的序列數(shù)據(jù)。兩人均注意到 lin - 4 非編碼 RNA 與 lin - 14 的 3'-UTR 中的多個(gè)元素之間存在顯著的部分互補(bǔ)性（圖 4）。
在意識(shí)到這一觀察結(jié)果的重要性后，兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步開(kāi)展了一系列實(shí)驗(yàn)，證實(shí) lin - 4 微 RNA 是通過(guò)與位于 3'-UTR 上的元件堿基互補(bǔ)配對(duì)來(lái)調(diào)控 lin - 14 的 mRNA。他們的這一開(kāi)創(chuàng)性發(fā)現(xiàn)于 1993 年發(fā)表在《細(xì)胞》雜志上，兩篇論文以 “背靠背” 的形式呈現(xiàn)。
圖 4. lin-4 和 lin-14 RNA 中的互補(bǔ)序列元件。通過(guò)比較 lin-4 和 lin-14 的克隆序列，他們發(fā)現(xiàn)了長(zhǎng)度為 22 個(gè)核苷酸的 lin-4 RNA 與 lin-14 的3'-UTR 中的重復(fù)元件存在部分互補(bǔ)性。（圖片來(lái)源：諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)委員會(huì)。插圖：Mattias Karlén）
基于秀麗隱桿線蟲(chóng)的 lin - 4 序列，安布羅斯實(shí)驗(yàn)室在其他線蟲(chóng)物種中鑒定出了包含 lin - 4 的克隆。這些實(shí)驗(yàn)顯示，來(lái)自其他線蟲(chóng)的 lin - 4 克隆能夠挽救 lin - 4 突變的秀麗隱桿線蟲(chóng)的表型。他們還篩選了超過(guò) 20000 個(gè)突變?nèi)旧w，鑒定出了第二個(gè) lin - 4 突變體（ma161），該突變體包含單個(gè)核苷酸突變。值得注意的是，這個(gè)突變位于互補(bǔ)序列內(nèi)，進(jìn)一步支撐了 lin - 4 微 RNA 與 lin - 14 的 3'-UTR 元件之間互補(bǔ)堿基的功能重要性。
魯夫昆實(shí)驗(yàn)室則對(duì)野生型和 lin - 14 功能獲得突變體中的 lin - 14 蛋白和 RNA 含量進(jìn)行了比較。突變體中的 lin - 14 蛋白水平提高了 4 至 7 倍，而 RNA 含量沒(méi)有差異，這表明 lin - 14 是在轉(zhuǎn)錄后水平（即 RNA 轉(zhuǎn)錄完成后）受到調(diào)控的。將 lin - 14 的 3'-UTR 轉(zhuǎn)入報(bào)告基因后，報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控與 lin - 14 相似，這表明異源 3'-UTR 足以控制 mRNA 翻譯。進(jìn)一步地，研究人員將 lin - 14 3'-UTR 的較小片段轉(zhuǎn)入報(bào)告基因，直至識(shí)別出一個(gè)功能性的 124 個(gè)核苷酸長(zhǎng)的 3'-UTR 片段。該 3'-UTR 區(qū)域包含多個(gè)與 lin - 4 部分互補(bǔ)的序列，并且該區(qū)域在雙桅隱桿線蟲(chóng)（C. briggsae）中也是保守的。
通過(guò)對(duì)新發(fā)現(xiàn)的 lin - 4 微 RNA 與來(lái)自所有物種的全面核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行計(jì)算分析，研究人員發(fā)現(xiàn)，與 lin - 4 相匹配的序列僅存在于其他線蟲(chóng)中，例如雙桅隱桿線蟲(chóng)。于是，一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題依然存在：微 RNA 的存在究竟是線蟲(chóng)特有的現(xiàn)象，還是在整個(gè)動(dòng)物界中都具有深遠(yuǎn)功能影響的保守性特征呢？
保的let-7微RNA
首個(gè)微 RNA 基因 lin - 4 “亮相” 七年后，第二個(gè)微 RNA 基因 let - 7 也被發(fā)現(xiàn)了。魯夫昆實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展了一項(xiàng)遺傳篩選，重點(diǎn)聚焦于一類(lèi)突變體，它們能夠抑制 lin - 14 和 egl - 35 位點(diǎn)突變的合成不育表型。let - 7 編碼一個(gè)由 21 個(gè)核苷酸組成的短鏈 RNA，該 RNA 與多個(gè)異時(shí)性基因的 3'-UTRs（包括 lin - 14、lin - 28、lin - 41、lin - 42 和 daf - 12）具有互補(bǔ)性。let - 7 的缺失會(huì)致使成蟲(chóng)重復(fù)出現(xiàn)幼蟲(chóng)階段的細(xì)胞命運(yùn)，這表明微 RNA 或許在調(diào)控細(xì)胞系形成的階段特異性時(shí)序方面發(fā)揮著更廣泛的作用。
下一個(gè)突破同樣來(lái)自魯夫昆實(shí)驗(yàn)室。他們發(fā)現(xiàn)，與 lin - 4 不同，let - 7 基因在多種動(dòng)物中具有演化保守性�？茖W(xué)家將 let - 7 微 RNA 的序列與核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果在果蠅和人類(lèi)中都找到了匹配序列。在秀麗隱桿線蟲(chóng)中，let - 7 的一個(gè)已知靶標(biāo)是 lin - 41，這是一種在斑馬魚(yú)和果蠅中具有同源蛋白的蛋白質(zhì)。令人欣喜的是，斑馬魚(yú)和果蠅 lin - 41 同源基因的 3'-UTR 均顯示出與 let - 7 的互補(bǔ)性。此外，多種人體組織中也存在 let - 7 微 RNA，這表明 let - 7 與哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因表達(dá)普遍相關(guān)。
與線蟲(chóng)類(lèi)似，let - 7 微 RNA 在果蠅中也呈現(xiàn)出時(shí)序調(diào)控性，這表明 let - 7 在昆蟲(chóng)、甲殼類(lèi)和線蟲(chóng)中具有保守作用。值得注意的是，科學(xué)家在軟體動(dòng)物和環(huán)節(jié)動(dòng)物的成體階段也檢測(cè)到了時(shí)序性質(zhì)的 let - 7 表達(dá)，而這些物種并沒(méi)有幼蟲(chóng)階段。此外，脊椎動(dòng)物也沒(méi)有明顯的幼蟲(chóng)階段，但在發(fā)育過(guò)程中也出現(xiàn)了時(shí)序調(diào)控的 let - 7 表達(dá)（包括在成年斑馬魚(yú)中的強(qiáng)烈表達(dá)）。令人印象深刻的是，在具有左右對(duì)稱性的動(dòng)物中，let - 7 的表達(dá)也是時(shí)序調(diào)控的，這種特性可能是在這些動(dòng)物從雙胚層物種（即從兩個(gè)主要胚層發(fā)育而非三個(gè)，如人類(lèi)和其他脊椎動(dòng)物）分化后演化產(chǎn)生的（圖 5）。let - 7 在演化上高度保守，極大地增加了人們對(duì)微 RNA 作為基因表達(dá)后轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的興趣。
圖 5. let-7 RNA 表達(dá)及微 RNA 的演化保守性。 左圖：一個(gè)后生動(dòng)物的演化樹(shù)，突出顯示了能檢測(cè)到 let-7 微 RNA 表達(dá)（+）或沒(méi)能檢測(cè)到 let-7 微 RNA 表達(dá)（-）的物種分支。具有相似 let-7 RNA 表達(dá)發(fā)育模式的物種（早期階段無(wú) let-7 但成年期表達(dá) let-7）用“Dev.”表示。右圖：微 RNA 基因在多細(xì)胞生物的基因組中已經(jīng)演化并擴(kuò)展了超過(guò) 5 億年。 （圖片來(lái)源：諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)委員會(huì)。制圖：Mattias Karlén）
隨著 let - 7 的被發(fā)現(xiàn)，借助小 RNA 克隆技術(shù)，多個(gè)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)始在人類(lèi)及其他物種中探尋其他微 RNA。例如，Thomas Tuschl 實(shí)驗(yàn)室從人體和果蠅組織中克隆出新的微 RNA，David Bartel 實(shí)驗(yàn)室從線蟲(chóng)中分離出新的微 RNA，安布羅斯的實(shí)驗(yàn)室也進(jìn)行了類(lèi)似的研究。如今，這些綜合證據(jù)極具說(shuō)服力：動(dòng)物界中存在大量調(diào)控性微 RNA，極可能在基因調(diào)控中發(fā)揮重要作用。分子生物學(xué)和測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步使得我們?cè)谌祟?lèi)基因組中已鑒定出超過(guò)一千種微 RNA 基因。目前，微 RNA 基因的數(shù)據(jù)庫(kù) miRBase 已涵蓋超過(guò) 38000 個(gè)發(fā)卡前體和 48860 個(gè)成熟的微 RNA 基因序列，涉及 271 個(gè)物種；甚至在病毒中，科學(xué)家也找到了編碼微 RNA 的基因。
由于更多微 RNA 的克隆以及全基因組序列技術(shù)的日益完善，科學(xué)家能夠更好地找出微 RNA 與 3'-UTR 區(qū)域之間的堿基配對(duì)規(guī)則。David Bartel、Christopher Burge 和 Stephen Cohen 實(shí)驗(yàn)室提出了將實(shí)驗(yàn)和比較基因組學(xué)方法相結(jié)合的研究規(guī)范，專門(mén)用于識(shí)別微 RNA 靶標(biāo)。這些研究表明，微 RNA 通常與目標(biāo) mRNA 具有部分互補(bǔ)性，主要集中在微 RNA 的 “種子” 區(qū)域。該研究還揭示，每個(gè)微 RNA 可能調(diào)控多個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因，因?yàn)樵S多基因的 3'-UTR 區(qū)域呈現(xiàn)出與微 RNA 種子序列的極度保守性互補(bǔ)。
有趣的是，與細(xì)胞類(lèi)型或譜系特異性微 RNA 共表達(dá)的基因缺乏該特定微 RNA 的目標(biāo)位點(diǎn)。與之相反，這類(lèi)微 RNA 靶點(diǎn)在相鄰細(xì)胞和組織中表達(dá)的基因中很常見(jiàn)。這些觀察結(jié)果強(qiáng)化了一種假說(shuō)，即微 RNA 在多細(xì)胞生物的細(xì)胞系形成以及細(xì)胞類(lèi)型穩(wěn)定性中具有重要功能。
微RNA的生物合成與功能
在克隆其他微 RNA 基因的同時(shí)，多個(gè)研究團(tuán)隊(duì)也投入了大量精力去理解微 RNA 的生物合成及其作用機(jī)制。微 RNA 基因的轉(zhuǎn)錄策略豐富多樣。許多微 RNA 基因是獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄單元，有時(shí)會(huì)成簇出現(xiàn)，而其他微 RNA 則位于蛋白質(zhì)編碼基因的內(nèi)含子中。典型的初級(jí)微 RNA（pri-microRNA）由 RNA 聚合酶 II 轉(zhuǎn)錄而成，具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)。這種發(fā)卡結(jié)構(gòu)作為底物，由細(xì)胞核內(nèi)特定的微處理器（一種包含 Drosha 內(nèi)切酶的異三聚體復(fù)合物）進(jìn)行加工，切斷其雙鏈以產(chǎn)生前體微 RNA（pre-microRNA），通常長(zhǎng)度為 60 - 70 個(gè)核苷酸，這是由安布羅斯實(shí)驗(yàn)室首先檢測(cè)到的（圖 2）。Exportin 5 和 RAN-GTP 促進(jìn)前體微 RNA 向細(xì)胞質(zhì)運(yùn)輸。
隨后，前體由 Dicer（一種最初由 Greg Hannon 實(shí)驗(yàn)室鑒定的內(nèi)切酶，屬于核糖核酸酶 III 家族成員之一）進(jìn)一步加工，形成微 RNA 雙鏈。這些微 RNA 鏈會(huì)被加載到含有 Argonaute 蛋白的沉默復(fù)合物上，而另一個(gè) “隨從鏈” 則會(huì)被取代。一旦微 RNA 鏈被加載到沉默復(fù)合物中，它就能夠通過(guò)減少翻譯和 / 或促進(jìn) mRNA 降解來(lái)執(zhí)行具有序列特異性的負(fù)調(diào)控。這種調(diào)控過(guò)程會(huì)涉及銜接蛋白質(zhì) TNRC6 和多聚腺苷酸結(jié)合蛋白 PABPC，它們可以招募脫腺苷酶復(fù)合物，縮短 mRNA 的多聚腺苷酸尾巴，從而根據(jù)細(xì)胞所處的環(huán)境（例如細(xì)胞的發(fā)育階段及其類(lèi)型），導(dǎo)致 mRNA 降解或翻譯被抑制。
微 RNA 功能處理和執(zhí)行的機(jī)制同樣可用于其他基于 RNA 的沉默機(jī)制，通常稱為 RNA 干擾（RNAi）。其中包括小干擾 RNA（siRNAs）、內(nèi)源性 piwi 相互作用 RNA（piRNAs）和重復(fù)相關(guān)小干擾 RNA（rasiRNAs）。有關(guān)雙鏈 RNA 可以誘導(dǎo)序列依賴性基因沉默的發(fā)現(xiàn)，使安德魯・Z・法爾和克雷格・C・梅洛獲得了 2006 年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。雖然 RNAi（在低復(fù)雜性的植物和動(dòng)物中）主要用于防御病毒感染以及對(duì)抗不必要的基因組移動(dòng)元件活動(dòng)，但微 RNA 在發(fā)育過(guò)程和成體的不同細(xì)胞中會(huì)參與 mRNA 的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。為此，微 RNA 已演化出與其目標(biāo) mRNA 序列相應(yīng)的部分互補(bǔ)性，以 “調(diào)整” 對(duì)每個(gè) mRNA 目標(biāo)的影響，而例如 siRNAs 通常是外源的，與特定 RNA 目標(biāo)序列具有完全互補(bǔ)性，并會(huì)切割這些序列。1999 年，David Baulcombe 證明植物中的轉(zhuǎn)錄后基因沉默與具有特異性的短 RNA 對(duì)靶序列進(jìn)行處理有關(guān)，這進(jìn)一步將不同領(lǐng)域中的觀察聯(lián)系了起來(lái)。
微RNA的演化及其生理作用
微RNA基因的出現(xiàn)及發(fā)展與更復(fù)雜生物體的演化緊密相連（圖 5）。在早期兩側(cè)對(duì)稱動(dòng)物的演化進(jìn)程中，微RNA基因的數(shù)量顯著增多，據(jù)推測(cè)，它們?cè)谠趧?dòng)物和后口動(dòng)物分開(kāi)之前的兩側(cè)對(duì)稱動(dòng)物的最后共同祖先中發(fā)揮作用。自那時(shí)起，隨著復(fù)雜生物體中出現(xiàn)更為特化的細(xì)胞類(lèi)型和組織，又有數(shù)百個(gè)額外的微 RNA 基因誕生。在早期的后生動(dòng)物海綿、植物以及兩種單細(xì)胞真核生物物種中，科學(xué)家也尋找到了微 RNA 基因。因此，微RNA可能在演化過(guò)程中多次出現(xiàn)，或許出現(xiàn)在大約 6 億年前多細(xì)胞動(dòng)物早期譜系，又或者在 10 億年前植物和動(dòng)物的共同祖先中。值得注意的是，許多演化上古老的微 RNA 基因在后來(lái)的生物中得以保留。另外，這些基因在演化過(guò)程中很少丟失，這表明它們?cè)诨蛘{(diào)控中起著至關(guān)重要的作用。
通過(guò)消除微 RNA 生物合成途徑中的組分，科學(xué)家證實(shí)了微 RNA 在多細(xì)胞生物發(fā)育和組織功能中的關(guān)鍵作用。負(fù)責(zé)在細(xì)胞質(zhì)中處理前體微 RNA 的 Dicer 的缺失，會(huì)導(dǎo)致小鼠和斑馬魚(yú)胚胎致死。在果蠅和小鼠中，單個(gè)或一組微 RNA 基因的缺失也會(huì)引發(fā)強(qiáng)烈的表型變化。然而，由于多個(gè)微 RNA 基因可能作用于相同的目標(biāo)序列，存在冗余作用，使得單個(gè)微 RNA 基因的功能被掩蓋。盡管這些系統(tǒng)中的冗余性阻礙了科學(xué)家對(duì)單個(gè)微 RNA 基因功能的深入研究，但它也展現(xiàn)了該系統(tǒng)的穩(wěn)健性，并解釋了為何該系統(tǒng)不易被病毒等外界因素輕易操控。
為凸顯微 RNA 的基礎(chǔ)作用，值得關(guān)注的是，在兩側(cè)對(duì)稱生物中共享的、演化上最為保守的微 RNA 基因在胚胎發(fā)育早期發(fā)揮作用，而那些在哺乳動(dòng)物中特別演化出的微 RNA 則在胚胎發(fā)育后期階段發(fā)揮作用。相比之下，物種特異性的微 RNA 基因通常在成體細(xì)胞類(lèi)型中起作用，而非在胚胎發(fā)育過(guò)程中。通過(guò)對(duì)不同演化保守性的微 RNA 基因進(jìn)行系統(tǒng)性敲除實(shí)驗(yàn)，這些模式清晰可見(jiàn)。在動(dòng)物發(fā)育過(guò)程中，微 RNA 的特定調(diào)控作用包括調(diào)控發(fā)育時(shí)序、細(xì)胞命運(yùn)的形成和穩(wěn)定性，以及普遍生理學(xué)和內(nèi)穩(wěn)態(tài)。
通過(guò)選擇性地將 Dicer 從轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)敲除，研究人員闡明了微 RNA 在成體細(xì)胞和組織中的功能。例如，在 B 細(xì)胞成熟過(guò)程的早期，敲除 Dicer1 會(huì)使該細(xì)胞分化停滯在祖 B 細(xì)胞階段。在胚胎發(fā)育的第 15.5 天，從神經(jīng)元中敲除 Dicer1 會(huì)導(dǎo)致新生兒過(guò)早死亡，同時(shí)伴有小頭畸形、神經(jīng)元樹(shù)突分支減少和樹(shù)突棘長(zhǎng)度增加。在胚胎發(fā)育兩周時(shí)，在分裂后的小腦浦肯野細(xì)胞中敲除 Dicer1，會(huì)引發(fā)小腦退化和共濟(jì)失調(diào)（肌肉運(yùn)動(dòng)不協(xié)調(diào)）。同樣，中腦多巴胺能神經(jīng)元中 Dicer1 的缺失會(huì)導(dǎo)致漸進(jìn)性神經(jīng)元喪失和運(yùn)動(dòng)活動(dòng)減少。研究人員在其他多種細(xì)胞類(lèi)型和組織中也觀察到了嚴(yán)重的表型，證明微 RNA 在發(fā)育過(guò)程和成體細(xì)胞類(lèi)型的功能中具有關(guān)鍵作用。
隨著越來(lái)越多與特定微 RNA 基因突變或相關(guān)生物合成通路中的成分突變相關(guān)的綜合征被發(fā)現(xiàn)，微 RNA 在人類(lèi)發(fā)育和機(jī)體功能中的重要性愈發(fā)明顯。例如，DICER1 綜合征是一種罕見(jiàn)的遺傳性疾病，由 DICER1 基因突變引起，患者易患腎、甲狀腺、卵巢、宮頸、睪丸、腦、眼和肺的腫瘤。在這些患者體內(nèi)，通常 DICER1 的一個(gè)等位基因存在使其失活的胚系突變，降低了細(xì)胞中功能性 DICER1 蛋白的含量。這些個(gè)體容易發(fā)生額外的體細(xì)胞突變，因此往往在兒童期就發(fā)展出腫瘤。
微RNA基因的堿基配對(duì)部分（即種子序列）較短，使得它們不太可能因隨機(jī)突變而改變。然而，已知微 RNA 基因的種子序列中存在與疾病相關(guān)的突變，其中包括與進(jìn)行性聽(tīng)力損失相關(guān)的 miRNA - 96 突變、導(dǎo)致 EDICT 綜合征（一種罕見(jiàn)的眼疾，表現(xiàn)為虹膜發(fā)育不全、內(nèi)皮營(yíng)養(yǎng)不良和先天性白內(nèi)障）的 miRNA - 184 突變，以及導(dǎo)致先天性骨骼疾病的 miRNA - 140 - 5p 突變。目前，針對(duì)代謝紊亂、心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病和癌癥等疾病，基于微 RNA 的診斷和治療方法正在不斷取得進(jìn)展。
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