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 主 要 簡 介

血液外泌體正在成為診斷阿爾茨海默�。ˋD）等腦部疾病的潛在生物標(biāo)志物。目前缺乏一種超靈敏的技術(shù)來識別血液外泌體中的核心AD生物標(biāo)志物，以優(yōu)化生物標(biāo)志物在臨床實踐中的效用。在這里，使用DNA偶聯(lián)抗體開發(fā)了一種免疫磁性外泌體聚合酶鏈反應(yīng)（iMEP）平臺，用于快速檢測臨床血液外泌體中的淀粉樣蛋白β（aβ_1–40和aβ_1–42）和磷酸化tau（p-tau ^396，404和p-tau¹⁸¹）。Toehold位移介導(dǎo)的DNA親和力下拉消除了高檢測背景，允許檢測濃度低至每毫升10飛克的生物標(biāo)志物。在iMEP檢測中，與外泌體p-tau¹⁸¹和p-tau^{396，404}相比，外泌體aβ_1–42在區(qū)分AD患者和健康個體方面更準(zhǔn)確，靈敏度為95.0%，特異性為95.0%。iMEP技術(shù)還擅長量化與疾病發(fā)病相關(guān)的不同外體生物標(biāo)志物的水平。

【本文研究的意義】

阿爾茨海默病（AD）是一種進行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其病理過程涉及Aβ斑塊（A）、tau纏結(jié)（T）和進行性神經(jīng)退行性（N）的聚集。此外，它們結(jié)合的ATN框架允許對AD進行診斷和分期。AD的臨床評估現(xiàn)在越來越依賴于神經(jīng)病理學(xué)驗證的生物標(biāo)志物Aβ和tau。美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)了神經(jīng)影像學(xué)和CSF生物標(biāo)志物在AD早期診斷中的應(yīng)用，但它們的高成本、有限的可及性和侵入性限制了它們作為首選AD診斷工具的使用。使用基于血液的生物標(biāo)志物可以實現(xiàn)低成本、廣泛可用和無創(chuàng)的AD早期診斷，因此，通過血液測試進行AD篩查將是邁向早期干預(yù)、減輕社會負(fù)擔(dān)的重要一步。

盡管已報道血漿神經(jīng)元外泌體可作為AD的生物標(biāo)志物，但缺乏特定的分離和提取方法限制了對神經(jīng)元外泌體的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用。這可能是因為血液外泌體的異質(zhì)性以及在高靈敏度下檢測血液外泌體中生物標(biāo)志物的困難。在此，研究人員描述了一種敏感的檢測平臺，稱為免疫磁性外泌體聚合酶鏈反應(yīng)（iMEP），用于快速檢測核心AD生物標(biāo)志物（Aβ_1–42、Aβ_1–40、p-tau^396,404和p-tau¹⁸¹）（圖1），該平臺實現(xiàn)了對血液外泌體的富集和多個血液生物標(biāo)志物的敏感檢測。

iMEP系統(tǒng)整合了血液外泌體的免疫磁性富集、外泌體上生物標(biāo)志物的免疫識別和實時PCR。在該系統(tǒng)中，研究人員采用了拓展置換介導(dǎo)的DNA親和富集，將富集的外泌體結(jié)合抗體的DNA-抗體偶聯(lián)物純化步驟�？紤]到夾心ELISA的特異性和PCR信號放大的結(jié)合，與富集的外泌體結(jié)合抗體的DNA偶聯(lián)物的iMEP能夠可靠地檢測到濃度低至10 fg/ml的目標(biāo)分子。該方法可以選擇性地鑒定血液外泌體中的各種與AD相關(guān)的生物標(biāo)志物，并通過估算血液外泌體中AD生物標(biāo)志物的水平區(qū)分臨床診斷為AD的患者與健康個體。

主要內(nèi)容

1、基于血液外泌體的iMEP檢測的實現(xiàn)

圖2A總結(jié)了iMEP檢測抗原的工作原理，該方法是通過磁珠富集結(jié)合DNA-抗體共軛物來實現(xiàn)的。首先以Aβ1–42肽為例；將抗Aβ1–42初級抗體（1F12）修飾在涂覆的磁珠上，采用雙抗體夾心和核酸分子嵌合物的方法。與Aβ1–42結(jié)合后進行磁性分離，然后引入抗Aβ1–42次級抗體-DNA共軛物（DNA-2C6），構(gòu)建了使用1F12共軛磁珠和DNA-2C6共軛物的雙抗體夾心免疫測定平臺。隨后通過ELISA驗證了抗Aβ1–42抗體的特異性和結(jié)合親和性（圖2B），發(fā)現(xiàn)該抗體對目標(biāo)具有很強的選擇性特異性和高結(jié)合親和力，抗體和抗原之間的平衡解離常數(shù)（Kd）約為10。

CD63是一種經(jīng)典的四跨膜標(biāo)記，在各種外泌體表面高度表達。因此，生物素化的CD63抗體能夠有效捕獲和積累CD63標(biāo)記的外泌體。因此在該實驗中，使用了生物素化的CD63抗體和抗生物素陽性磁珠對血液外泌體進行簡單富集。血液外泌體的透射電鏡（TEM）圖像顯示了囊泡結(jié)構(gòu)（圖2C），其大小范圍為90至200 nm（圖2D）。同時，為了確定iMEP系統(tǒng)是否正確識別了外泌體中的Aβ，進行了與AuNP結(jié)合的抗Aβ1–42抗體的囊泡的TEM，圖2E的結(jié)果表明了外泌體成功與Aβ1–42蛋白進行了結(jié)合。

隨后，研究人員評估了iMEP在不同檢測環(huán)境中定量檢測生物標(biāo)志物的能力。在200倍（0.5%）稀釋的全血、血漿和外泌體中測試了一系列稀釋梯度的Aβ1–42樣品。結(jié)果顯示，隨著Aβ1–42濃度的增加，實時熒光曲線清晰地顯示出放大和較短的循環(huán)閾值（Ct）值。之后通過閾值分析，比較了全血、血漿和外泌體稀釋中的檢測靈敏度，發(fā)現(xiàn)外泌體稀釋環(huán)境中檢測背景值最低。將樣品與背景之間的ΔCt值與Aβ1–42濃度繪制在一起后，發(fā)現(xiàn)隨著Aβ1–42濃度的增加，ΔCt值呈線性增加（圖2，F(xiàn)至H）。同時計算得出，iMEP在全血樣品中的最低檢測濃度為0.1 pg/ml，進一步證明DNA-抗體實時PCR可直接應(yīng)用于全血、血漿和外泌體中低豐度生物標(biāo)志物的檢測�？偟膩碚f，iMEP檢測平臺在外泌體樣品中顯示出最低的背景信號。該iMEP檢測方法在臨床樣本中的檢測限為100 fg/ml，考慮到外泌體中AD生物標(biāo)志物的濃度（5至200 pg/ml），該iMEP平臺完全可以滿足臨床樣本的檢測限制。

2、合成的Aβ_1-42多肽檢測iMEP的敏感性

傳統(tǒng)免疫-PCR技術(shù)的最突出缺點是PCR的高背景信號，這種干擾的主要原因包括DNA和DNA-抗體共軛物中的過量抗體。過量抗體的非特異性結(jié)合到固相載體上可能會影響免疫測定結(jié)果，并且通過PCR可以放大這種背景信號。

為了進一步改善非特異信號并提高iMEP的重現(xiàn)性，第一步是設(shè)計DNA-抗體共軛物的純化過程。如圖3A所示，toehold位移介導(dǎo)的DNA親和力在純化步驟中去除了過量未結(jié)合的抗體。因此，抗原可以與盡可能多的DNA-抗體共軛物結(jié)合，從而提高了測定的靈敏度和準(zhǔn)確性。隨后使用DNA-抗體實時PCR檢測系統(tǒng)比較了DNA-抗體共軛物純化前后檢測到的背景信號和靈敏度的差異。通過將Aβ_1–42肽（100 pg/ml）添加到陽性組的稀釋血清中，發(fā)現(xiàn)純化后的熒光信號比純化前增加了1.3倍，對應(yīng)的ΔCt值差異為2.3（圖3B），表明純化組的信號更敏感。并且如圖3C所示，每個循環(huán)都監(jiān)測了歸一化的報告信號（Rn）的增加，并且使用了前7.5個循環(huán)作為背景信號進行基線校正。鑒于Ct值與DNA模板量成反比，因此也與抗原濃度成反比。所以在圖3C中，起始模板濃度越高，就越早觀察到熒光增強，但Ct值越小。實驗也發(fā)現(xiàn)，Aβ_1–42濃度（x）和ΔCt值（y，定義為每個Aβ_1–42濃度與沒有Aβ_1–42的控制免疫球蛋白G（IgG）（即背景）之間的Ct差異）之間有強線性關(guān)系，其動態(tài)范圍橫跨了七個數(shù)量級（線性方程為y = 0.689x + 1.41（R2 = 0.99）），iMEP測定的檢測限（LOD）確定為10 fg/ml（圖3D）。接下來，研究人員進行了傳統(tǒng)ELISA雙抗體夾心法測定，用于測量上述范圍內(nèi)七個數(shù)量級的Aβ_1–42，并且在10至105 pg/ml的范圍內(nèi)觀察到了Aβ_1–42濃度（x）和450 nm處的光密度（OD450）值（y）之間的線性相關(guān)性（圖3E），其方程為y = 6.89 × ln（x+ 907060.18）– 94.3（R² = 0.954）。Aβ_1–42夾心ELISA檢測的檢測限為10 pg/ml，比iMEP達到的LOD高了103倍（圖3F）。這些結(jié)果證明了iMEP檢測的高靈敏度和定量能力。

3、iMEP對Aβ_1-42在血漿和血液外泌體中的作用

為了驗證iMEP在真實樣本中的有效性，使用了C57BL/6和5×FAD轉(zhuǎn)基因小鼠的血漿和血液外泌體樣本。結(jié)果顯示，在C57BL/6和5×FAD小鼠的血漿中檢測到了Aβ_1–42（圖4，A至C）。同時實驗收集了血漿樣本（n = 20）進行雙抗體夾心ELISA，通過計算，在5×FAD小鼠和C57BL/6對照組之間觀察到Aβ_1–42水平的顯著差異（P = 0.0011，未配對t檢驗）。隨后通過雙抗體夾心ELISA檢測了C57BL/6和5×FAD小鼠外泌體（n = 20）中的Aβ_1–42水平（圖4，D至F），實驗基于夾心ELISA調(diào)查了20個獨立的血液外泌體樣本，并且也在5×FAD小鼠和C57BL/6對照組之間觀察到Aβ_1–42水平的顯著差異（P = 0.0002，未配對t檢驗）。特別是，如圖4（G至I）所示，iMEP在5×FAD小鼠和C57BL/6對照組之間檢測到外泌體Aβ_1–42水平的差異非常顯著（P < 0.0001，未配對t檢驗）。對通過ELISA測量的血漿中Aβ_1–42水平（血漿-ELISA）和通過ELISA測量的外泌體中Aβ_1–42水平（外泌體-ELISA）進行的受試者工作特征（ROC）曲線的差異分析（圖4，J和K）進一步證明了iMEP檢測方法的優(yōu)異檢測靈敏度，有利于AD的診斷和分析。

4、單個血液樣本中多個生物標(biāo)志物的臨床檢測

由于血液外泌體含有來源于不同細(xì)胞類型（如神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞）和組織的各種外泌體，因此它們可能更有潛力反映AD進展中生物標(biāo)志物的變化水平。為了進一步證明iMEP檢測外泌體中Aβ水平的優(yōu)越性，研究人員使用iMEP檢測方法比較了血液神經(jīng)元源性外泌體與健康個體和AD患者血液外泌體中AD生物標(biāo)志物的差異水平。如圖5A所示，通過免疫親和捕獲，兩種類型的外泌體，血液外泌體（CD63⁺外泌體）和神經(jīng)元源性外泌體（神經(jīng)細(xì)胞黏附分子-陽性（NCAM⁺）外泌體），被富集。研究發(fā)現(xiàn)，用于區(qū)分健康個體和AD患者的AD生物標(biāo)志物水平在血液外泌體中差異更顯著（n = 10）。在血液外泌體中檢測到的與AD生物標(biāo)志物相對應(yīng)的ΔCt值通常高于在神經(jīng)元源性外泌體中檢測到的ΔCt值（圖5，B至E）；也就是說，在血液外泌體中檢測到的AD生物標(biāo)志物水平更高。此外，研究觀察到在健康個體和AD患者的血液外泌體中Aβ1–40水平存在顯著差異，而在神經(jīng)元源性外泌體中，健康個體和AD患者的Aβ_1–40水平相近。這些結(jié)果表明，血液外泌體能夠比神經(jīng)元源性外泌體更好地區(qū)分健康個體和AD患者。

為了評估iMEP的臨床適用性，研究人員比較了iMEP檢測與夾心ELISA檢測臨床樣本中血漿AD生物標(biāo)志物的敏感性。利用iMEP系統(tǒng)，在40個獨立的臨床血液外泌體樣本中測量了Aβ_1–42、Aβ_1–40、p-tau^396,404和p-tau¹⁸¹水平，并對每個樣本的ΔCt值進行了統(tǒng)計分析（n = 40，圖6，A至D）。如圖6E所示，在AD患者和健康個體之間血液外泌體Aβ_1–42水平存在顯著差異（P < 0.0001，未配對t檢驗）。此外，也利用夾心ELISA檢測了血液和外泌體樣本中Aβ_1–42的水平。結(jié)果表明，與健康個體相比，AD患者的血液和外泌體樣本中Aβ_1–42水平較高。然而，在血漿和外泌體樣本中使用夾心ELISA未檢測到Aβ_1–42的水平差異。未配對t檢驗的差異分析顯示，iMEP的檢測敏感性顯著高于夾心ELISA，P值接近0.0002。作為參考，使用Aβ-PET、CSF p-tau¹⁸¹和蒙特利爾認(rèn)知評估來評估AD的不同疾病階段的臨床診斷。在AD患者和健康個體之間的血液外泌體Aβ_1–40水平存在顯著差異（圖6F；P = 0.0003，未配對t檢驗）。此外，血液外泌體中p-tau^396,404（圖6G；P < 0.0001，未配對t檢驗）和p-tau¹⁸¹水平（P = 0.0003，圖6H）在AD患者和健康個體之間也存在顯著差異。然而，血液外泌體中p-tau^396,404的差異水平比p-tau¹⁸¹更顯著，表明使用血液外泌體中的p-tau^396,404作為預(yù)測因子可以更準(zhǔn)確地區(qū)分AD患者和健康個體。接下來，對應(yīng)于iMEP、外泌體-ELISA和血漿-ELISA的ROC曲線顯示，它們的ROC曲線下面積（AUC）值分別為0.993、0.769和0.613（圖6I）。同時也對血液外泌體中Aβ_1–42的水平在AD的不同階段進行了測量（圖6J），結(jié)果顯示血液外泌體中Aβ_1–42的濃度逐漸增加，與AD疾病的進展呈正相關(guān)。與健康個體相比，輕度至中度和嚴(yán)重AD患者的血液外泌體Aβ_1–42濃度顯著更高[P < 0.0001，單因素方差分析（ANOVA）]。

接下來，進一步調(diào)查了每個生物標(biāo)志物的AUC值。ROC分析是一種用于評估檢測靈敏性、特異性和準(zhǔn)確性的標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計方法。AUC值量化了檢測方法的診斷準(zhǔn)確性，值為1.0表示完美的臨床預(yù)測。分析結(jié)果顯示，Aβ_1–42和p-tau^396,404的估計AUC值超過了0.95，而Aβ_1–40和p-tau¹⁸¹的估計AUC值分別為0.85和0.79（圖6K）。表明，作為預(yù)測因子的單一生物標(biāo)志物Aβ_1–42能夠以95.0%的靈敏度和95.0%的特異性成功區(qū)分AD患者和健康個體。當(dāng)使用Aβ_1–40、p-tau^396,404或p-tau¹⁸¹作為單一預(yù)測因子時，仍然能夠成功區(qū)分AD患者和健康個體，其平均靈敏度和特異性分別為81.7%和80.0%。

總結(jié)

1. 該文章基于免疫富集的外泌體和生物標(biāo)志物特異性抗體-DNA結(jié)合物的組合，開發(fā)出了一種能夠?qū)崟r量化生物標(biāo)志物含量的外泌體生物標(biāo)志物檢測平臺iMEP，該平臺在飛摩爾水平濃度下具有低背景信號、高特異性和高靈敏度的獨特優(yōu)勢。

2. 通過分析不同檢測環(huán)境（全血、血漿和外泌體）中Aβ_1–42肽的一系列濃度，發(fā)現(xiàn)外泌體環(huán)境中的信號背景最低。此外，iMEP在檢測臨床血液外泌體中的生物標(biāo)志物方面顯示出比檢測臨床血漿中更高的靈敏度。

3. iMEP反應(yīng)系統(tǒng)相較于傳統(tǒng)免疫PCR中高背景信號的顯著減少，可以歸因于在純化步驟中使用了一種toehold shift介導(dǎo)的DNA親和拉下方法來去除多余的未結(jié)合抗體。該系統(tǒng)與商業(yè)化的夾心ELISA相比，iMEP的檢測靈敏度提高了1000倍。

4. iMEP平臺可以在臨床血液外泌體樣本中精確量化Aβ_1–42、Aβ_1–40、p-tau^396,404和p-tau¹⁸¹等多個生物標(biāo)志物。并且證明了：（i）低豐度的血液外泌體生物標(biāo)志物Aβ_1–42和p-tau可能用于AD的診斷；（ii）外泌體Aβ_1–42對于AD的檢測比外泌體p-tau¹⁸¹和p-tau^396,404更有效；（iii）iMEP可以精確量化外泌體上的多個靶標(biāo)。

Hu, S., Zhang, L., Su, Y., Liang, X., Yang, J., Luo, Q., & Luo, H. (2024). Sensitive detection of multiple blood biomarkers via immunomagnetic exosomal PCR for the diagnosis of Alzheimer's disease. Science advances, 10(13), eabm3088. doi:10.1126/sciadv.abm3088