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結(jié)直腸癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，全球發(fā)病率居惡性腫瘤第3位，死亡率居第5位。在我國，結(jié)直腸癌發(fā)病率亦呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)。根據(jù) 2024年國家癌癥中心數(shù)據(jù)顯示，2020 年中國結(jié)直腸癌新發(fā)病例56萬，死亡病例 29萬。結(jié)直腸癌的早期篩查及預(yù)防可以降低發(fā)病率、提高治愈率，相關(guān)分子標(biāo)志物的檢測(cè)是結(jié)直腸癌篩查的有效補(bǔ)充，同時(shí)對(duì)個(gè)體化方案的判定、預(yù)后判斷及療效預(yù)測(cè)等方面起到重要作用。

◆檢驗(yàn)方法

目前，分子標(biāo)志物的檢測(cè)方法包括免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry，IHC）、熒光原位雜交技術(shù)（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）和基因測(cè)序等。不同類型的標(biāo)本和變異需要選擇不同的檢測(cè)方法。其中，IHC檢測(cè)是指用標(biāo)記的特異性抗體在組織細(xì)胞原位通過抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)，對(duì)相應(yīng)抗原進(jìn)行定性、定位、定量測(cè)定的一項(xiàng)免疫檢測(cè)方法。IHC檢測(cè)是腫瘤診療中的重要工具，對(duì)判定腫瘤來源、類型、惡性程度、耐藥和預(yù)后都提供了重要價(jià)值。專家表明：對(duì)于結(jié)直腸癌患者，推薦對(duì)經(jīng)手術(shù)切除或活檢的原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶組織標(biāo)本行相關(guān)分子標(biāo)志物的蛋白表達(dá)水平檢測(cè)，以幫助判定腫瘤來源和類型。

同時(shí),IHC也有一定的局限性，包括：1、常規(guī)免疫組化的分析屬于定性分析，其判斷大多依賴于經(jīng)驗(yàn)，其分析結(jié)果會(huì)有差異；2、常規(guī)免疫組化受傳統(tǒng)染色成像的限制，靶標(biāo)少于 3 個(gè)，無法完整分析組分信息等。2022年1月份卞修武院士發(fā)表了重要評(píng)論文章，指出傳統(tǒng)診斷病理學(xué)正向下一代診斷病理學(xué)（NGDP）邁進(jìn)，以病理形態(tài)和臨床信息為診斷基礎(chǔ)，以分子檢測(cè)與生物信息分析，多組學(xué)和跨尺度整合診斷是其主要特征，未來需要激發(fā)病理學(xué)科對(duì)創(chuàng)新活力，整合多組學(xué)技術(shù)，包括高通量測(cè)序、單細(xì)胞測(cè)序、轉(zhuǎn)錄組技術(shù)、多重蛋白原位標(biāo)記測(cè)定技術(shù)等，共同推動(dòng)臨床醫(yī)學(xué)的進(jìn)步。

其中，多重?zé)晒饷庖呓M化技術(shù)（mIHC）即是卞院士提到的多重蛋白原位標(biāo)記測(cè)定技術(shù)中的一種，是由檢測(cè)單一靶蛋白的標(biāo)準(zhǔn)IHC發(fā)展而來的組織檢測(cè)技術(shù)，也是下一代病理（NGP）技術(shù)的典型代表。mIHC是基于酪氨信號(hào)放大原理，可以在一張F(tuán)FPE組織切片中進(jìn)行多種（7-9）標(biāo)志物染色，通過各標(biāo)志物的在細(xì)胞上的單表達(dá)或者共表達(dá)，識(shí)別不同細(xì)胞亞群，結(jié)合人工智能軟件，將病理醫(yī)生的局部判讀轉(zhuǎn)為客觀算法，擴(kuò)展到全片的定量計(jì)算，統(tǒng)計(jì)各個(gè)組織區(qū)域中細(xì)胞類型、密度，空間位置關(guān)系等信息。

今天小編給大家分享結(jié)直腸癌常規(guī)免疫組化的標(biāo)志物，未來也可以通過mIHC對(duì)這些標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)。

◆IHC常規(guī)分子標(biāo)志物檢測(cè)

1、微衛(wèi)星不穩(wěn)定（microsatellite instability，MSI）狀態(tài)和錯(cuò)配修復(fù)（mismatch repair，MMR）蛋白表達(dá)

MSI 狀態(tài)和 MMR蛋白表達(dá)是包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的泛瘤種免疫檢查點(diǎn)抑制劑效果的預(yù)測(cè)指標(biāo)。

MMR蛋白的IHC檢測(cè)，需同時(shí)檢測(cè)4個(gè)常見MMR蛋白（MLH1、MSH2、MSH6和PMS2）的表達(dá)。其中≥1 種表達(dá)缺失，判定為錯(cuò)配修復(fù)基因缺陷（dMMR）；全部陽性，則判定為錯(cuò)配修復(fù)基因完整（pMMR）。

根據(jù)微衛(wèi)星的不同狀況可將患者分為3種即：高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI-H）、低度微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI-L）和微衛(wèi)星穩(wěn)定（microsatellite stable，MSS）。通常采用美國國家癌癥研究所推薦的5個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)（BAT25、BAT26、D5S346、D2S123和D17S250）進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)≥2個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)顯示MSI，即可診斷為MSI-H；1個(gè)顯示MSI，可診斷為MSI-L；沒有任何位點(diǎn)顯示MSI，即MSS。一般而言，dMMR相當(dāng)于MSI-H，pMMR相當(dāng)于MSI-L或MSS。

MSI-H狀態(tài)的Ⅱ期和Ⅲ期結(jié)直腸癌患者，其預(yù)后一般優(yōu)于MSS患者。MSI-H的Ⅱ期患者，一般預(yù)后較好，且不能從氟尿嘧啶（5-FU）類單藥化療中獲益，所以建議Ⅱ期患者術(shù)后常規(guī)進(jìn)行MSI檢測(cè)。此外，轉(zhuǎn)移性MSI-H/dMMR患者對(duì)于免疫檢查點(diǎn)抑制劑療效較好。Checkmate142研究表明，納武單抗有效率為31%。而非MSI-H/dMMR患者有效率則顯著較低。KEYNOTE-177 研究表明，MSI-H/dMMR 患者姑息一線應(yīng)用帕博利珠單抗，客觀緩解率為43.8%，而標(biāo)準(zhǔn)化療靶向組顯著較低，為33.1%。

MSI/MMR狀態(tài)對(duì)于遺傳性結(jié)直腸癌的診斷也具有較大的意義，尤其是林奇綜合征的診斷，MMR基因的胚系突變是確診的金標(biāo)準(zhǔn)。因此，對(duì)于臨床考慮遺傳性結(jié)直腸癌的患者，應(yīng)推薦常規(guī)進(jìn)行MSI/MMR狀態(tài)以幫助診斷；而對(duì)于其他結(jié)直腸癌患者，完善MSI/MMR狀態(tài)的檢測(cè)可為后續(xù)治療選擇提供參考依據(jù)。

2、結(jié)直腸癌診斷和鑒別診斷相關(guān)免疫組化標(biāo)記物

根據(jù)鑒別目的的選取，結(jié)直腸腺癌典型的免疫表型為CK7-/CK20+/CDX2+。

細(xì)胞角蛋白7（CK7），上皮來源標(biāo)記，通常在腺癌中表達(dá)，腺上皮和移行上皮細(xì)胞表達(dá)，非上皮來源細(xì)胞無表達(dá)。胃腸道的腺癌呈陰性。

細(xì)胞角蛋白20（CK20）主要存在于正常的胃腸道上皮、尿路上皮和 Merkel 細(xì)胞中，在來源的腫瘤上呈陽性反應(yīng)，但在乳腺癌、肺癌、卵巢非粘液性腺癌則呈陰性反應(yīng)。該抗體主要用于標(biāo)記胃腸道及其來源腫瘤。

尾型同源盒 2（CDX2）是一種腸特異的轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞的增殖和分化，對(duì)于腸上皮的正常形態(tài)和功能維持有一定作用。該抗體在結(jié)直腸腺癌中呈現(xiàn)較一致的強(qiáng)陽性細(xì)胞核表達(dá)，具有高度敏感性和特異性，主要用于結(jié)直腸腺癌與其他腺癌的診斷與鑒別。

特異 AT 序列結(jié)合蛋白 2（SATB2）是與核基質(zhì)結(jié)合區(qū)結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，在轉(zhuǎn)錄調(diào)控和染色質(zhì)重組等過程中具有重要作用。SATB2 在成人下消化道、闌尾、結(jié)直腸等上皮細(xì)胞和大腦皮層的神經(jīng)細(xì)胞呈強(qiáng)陽性表達(dá)，同時(shí) SATB2 也是成骨細(xì)胞分化的重要標(biāo)記物。SATB2 在結(jié)直腸癌中有很好的陽性率，其敏感性及特異性較高。

CEA是大腸癌分泌的一組酸性糖蛋白，廣泛存在于各種上皮性腫瘤(尤其是腺癌)。一般認(rèn)為,大腸癌分化程度越低,CEA陽性表達(dá)率越高。           

Villin，絨毛蛋白，刷狀緣的上皮細(xì)胞表達(dá)，通常腸癌表達(dá)陽性。

3、結(jié)直腸癌治療及預(yù)后相關(guān)標(biāo)志物

CSCO指南指出抗 HER-2治療和 NTRK 抑制劑的使用在結(jié)直腸癌治療中得到越來越多的重視。有條件的情況下對(duì)標(biāo)準(zhǔn)治療后失敗的結(jié)直腸癌患者可以進(jìn)行 HER-2狀態(tài)和NTRK基因融合的檢測(cè)。

HER2 免疫組化檢測(cè)

HER2 蛋白是表皮生長因子受體 EGFR/ERBB 家族中的成員之一，是參與細(xì)胞生長和分化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。目前在乳腺癌和胃癌患者中，抗 HER2 治療的發(fā)展比較迅速，在結(jié)直腸癌患者中也有一定的研究進(jìn)展：有研究顯示對(duì)于 KRAS 2號(hào)外顯子(12和13號(hào)密碼子)野生型且 HER2 擴(kuò)增，并且難以從標(biāo)準(zhǔn)治療方案中獲益的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者，抗 HER2 治療具有較好的療效。《2020 CSCO 結(jié)直腸癌診療指南》建議在有條件的情況下，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)治療后失敗的結(jié)直腸癌患者可以進(jìn)行 HER2狀態(tài)的檢測(cè)，為 Ⅲ 級(jí)專家推薦。目前結(jié)直腸癌 HER2 的檢測(cè)和判斷標(biāo)準(zhǔn)來自臨床研究方案，尚未建立經(jīng)過權(quán)威機(jī)構(gòu)認(rèn)證作為伴隨診斷的檢測(cè)流程和判讀標(biāo)準(zhǔn)。HER2 免疫組化結(jié)果判讀的標(biāo)準(zhǔn)為（表2）。

（1）陽性：≥50％ 的腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)細(xì)胞膜的基底和側(cè)邊或側(cè)邊或整個(gè)胞膜強(qiáng)陽性著色

（2）可疑陽性，滿足下面任何一條：

≥50％ 的腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)細(xì)胞膜的基底和側(cè)邊或側(cè)邊或整個(gè)胞膜中等陽性著色。

＞10%且＜50% 的腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)細(xì)胞膜的基底和側(cè)邊或側(cè)邊或整個(gè)胞膜強(qiáng)陽性著色。

（3）陰性，滿足下面任何一條：

＜10% 的腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)細(xì)胞膜的基底和側(cè)邊或側(cè)邊或整個(gè)胞膜強(qiáng)陽性著色。

＜50% 的腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)細(xì)胞膜的基底和側(cè)邊或側(cè)邊或整個(gè)胞膜強(qiáng)中等性著色。

無染色或微弱的膜染色。

HER2 免疫組化判讀為可疑陽性患者應(yīng)行 FISH 檢測(cè)進(jìn)一步明確 HER2 基因狀態(tài)，HER2 基因擴(kuò)增的陽性定義為大于50％的腫瘤細(xì)胞 HER2/CEP17 比值≥2.0，其余為陰性。

表2.結(jié)直腸癌HER2免疫組化染色結(jié)果判讀圖片

NTRK基因融合在結(jié)直腸癌中非常罕見，發(fā)生率約為0.35%，僅限于RAS和BRAF野生型的結(jié)直腸癌，且絕大多數(shù)為dMMR/MSI-H的結(jié)直腸癌檢測(cè)NTRK基因融合的方法有多種，免疫組織化學(xué)染色是一種快速、經(jīng)濟(jì)的初篩方法，但對(duì)NTRK基因融合仍需使用FISH或NGS方法進(jìn)行驗(yàn)證。

Ki67是一種核蛋白，與細(xì)胞增殖有關(guān)，其值大小反映了腫瘤細(xì)胞的增殖速度。數(shù)值越高，說明細(xì)胞增生越活躍，腫瘤生長越快，組織分化越差，患者預(yù)后越差。

◆總結(jié)

綜上所述，免疫組化是明確腫瘤良惡性程度如何，以及判斷腫瘤是原發(fā)還是轉(zhuǎn)移等等問題的有效手段。但是不同癌種，不同分型免疫組化生物標(biāo)志物不同且數(shù)目較多。隨著醫(yī)療科技的飛速發(fā)展，多重免疫組化（mIHC）可以實(shí)現(xiàn)在一張切片原位同時(shí)檢測(cè)7-9個(gè)靶標(biāo)，不僅可以實(shí)現(xiàn)多因子共定位，獲取更多的生物信息，還可以利用軟件對(duì)組織中的細(xì)胞進(jìn)行精準(zhǔn)的結(jié)果分析，且樣本需求量較少。作為腫瘤病理領(lǐng)域的領(lǐng)軍企業(yè)，闊然生物一直致力于推廣和應(yīng)用多重?zé)晒饷庖呓M化技術(shù)，為臨床病理科提供創(chuàng)新且全面的下一代病理（NGP）解決方案，助力病理行業(yè)發(fā)展進(jìn)入新時(shí)代。

參考文獻(xiàn)

[1]中國臨床腫瘤學(xué)會(huì)（CSCO）結(jié)直腸癌專家委員會(huì). 結(jié)直腸癌分子標(biāo)志物臨床檢測(cè)中國專家共識(shí)［J］.中華胃腸外科雜志，2021,24(3):191⁃197.

[2]中國臨床腫瘤學(xué)會(huì)（CSCO）結(jié)直腸癌診療指南2023

來源：闊然生物