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摘要
目的：建立同位素稀釋液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（ID-LC-MS/MS）檢測全血免疫抑制劑（他克莫司、西羅莫司、依維莫司和環(huán)孢素A）的候選參考方法，并評價其性能。方法 采用蛋白沉淀法（PPT）對全血樣本進行前處理，采用ID-LC-MS/MS定量檢測他克莫司、西羅莫司、依維莫司和環(huán)孢素A。對建立的候選參考方法的分析性能（線性、定量限、基質(zhì)效應、精密度和正確度等）進行評估。結果 ID-LC-MS/MS檢測他克莫司、西羅莫司、依維莫司和環(huán)孢素A的總檢測時間為4.5 min；環(huán)孢素A的線性范圍為10～500 ng/mL，定量限為10 ng/mL；他克莫司、西羅莫司和依維莫司的線性范圍均為1～50 ng/mL，定量限均為1 ng/mL。4種免疫抑制劑的相對基質(zhì)效應范圍均≤8.64%，批內(nèi)、批間變異系數(shù)（CV）均≤5%，加標回收率為98.84%～100.99%。他克莫司的擴展測量不確定度≤7.91%（k=2）、西羅莫司≤7.97%（k=2），依維莫司≤7.14%（k=2），環(huán)孢素A≤7.91%（k=2）。結論 成功建立了ID-LC-MS/MS檢測全血他克莫司、西羅莫司、依維莫司和環(huán)孢素A的候選參考方法，可用于相關項目的量值溯源和標準化。
關鍵詞
免疫抑制劑；同位素稀釋液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜；參考方法；性能評估
1、材料和方法
1.1 儀器與試劑
1.2 方法
1.2.1 標準品和內(nèi)標制備
采用重量法制備他克莫司、西羅莫司和依維莫司濃度為10 μg/mL的混合標準儲備液，環(huán)孢素A濃度為40 μg/mL的標準儲備液，均用甲醇稀釋制備，-20 ℃密封避光保存。精密稱取不同質(zhì)量的他克莫司、西羅莫司、依維莫司混合標準儲備液和環(huán)孢素A標準儲備液，制備5個濃度梯度的混合標準工作液（他克莫司、西羅莫司、依維莫司濃度均為50、20、10、5、1 ng/mL，環(huán)孢素A濃度為500、200、100、50、10 ng/mL），-20 ℃密封避光保存。他克莫司、西羅莫司和依維莫司的校準范圍為1～50 ng/mL，環(huán)孢素A的校準范圍為10～500 ng/mL。采用重量法分別制備他克莫司-13Cd4、西羅莫司-d3、依維莫司-d4、環(huán)孢素A-d4的標準儲備液，并以此為基礎，制備混合內(nèi)標工作液（他克莫司-13Cd4、西羅莫司-d3、依維莫司-d4濃度為20 ng/mL，環(huán)孢素A-d4濃度為200 ng/mL），-20 ℃密封避光保存。
1.2.2 樣本前處理
用重量法準確稱取100 μL混合標準工作液或全血樣本（全血樣本在處理前-80 ℃冰凍至少10 min，以保證充分溶血），置于2 mL離心管中，加入100 μL混合內(nèi)標工作液（重量法），然后加入300 μL甲醇與0.3 mol/L硫酸鋅的混合溶液（V∶V=1∶1），旋渦混勻10 min，20 000×g離心10 min，吸取上清液，用親水性針式過濾器（13.00 mm×0.22 μm，聚四氟乙烯）過濾，取150 μL濾液，加入帶有玻璃內(nèi)插管的進樣瓶中，進樣檢測。
1.2.3 液相色譜條件
色譜柱為accucore PFP 色譜柱；流動相A為含有2 mmol/L乙酸銨的甲醇溶液，流動相B為含有2 mmol/L乙酸銨的水溶液，流速為0.45 mL/min，柱溫為60 ℃，進樣量為4 μL，梯度洗脫（0.0～1.0 min，40%B；1.0～3.5 min，0%B；3.50～3.51 min，0%～40%B；3.51～4.50 min，40%B）。
1.2.4 質(zhì)譜分析條件
離子源為電噴霧電離源（electrospra yionization，ESI），離子化方式為正離子模式，離子化電壓為5 500 V，霧化溫度為400 ℃，碰撞氣強度為Medium，氣簾氣、霧化氣和輔助加熱氣分別為25、40、40 psi。以多反應監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式掃描分析。具體參數(shù)見表1。
1.3 ID-LC-MS/MS候選參考方法性能評估
1.3.1 選擇性和特異性
通過基質(zhì)匹配雙空白樣本信號確認檢測系統(tǒng)的背景噪音，并進行連續(xù)監(jiān)測，以評估方法特異性和選擇性。選取來源于5名健康志愿者的雙空白（不含分析物和內(nèi)標）全血樣本，分別進行前處理后進樣分析，獲得全血基質(zhì)下的總離子流圖；分別提取每個分析物及其內(nèi)標的選擇性反應檢測色譜圖，若在每個分析物預期的保留時間處無任何基質(zhì)干擾信號，且背景噪音較小，可認為方法具有良好的特異性和選擇性。另外，通過監(jiān)測定性離子對與定量離子對的離子豐度比來判斷是否存在未知干擾物。
1.3.2 基質(zhì)效應
采用基質(zhì)混合實驗的方法檢測相對基質(zhì)效應。選取來源于5名健康志愿者的空白全血樣本，按照加標的方式分別制備5個相同濃度的含藥全血樣本，然后通過檢測5種混合基質(zhì)樣本[溶液基質(zhì)樣本（標準溶液）、全血基質(zhì)樣本和二者體積比分別為5∶5、8∶2、2∶8的混合物]中每個分析物與對應內(nèi)標的峰面積比值來計算相對基質(zhì)效應。如果3種混合物的相對基質(zhì)效應<20%，則視為無相對基質(zhì)效應。
1.3.3 定量限
通過向空白全血樣本中加入混合標準工作液的方式制備包括預期的定量限濃度在內(nèi)的4個濃度梯度的樣本，分別計算每個濃度梯度樣本中每個分析物的理論濃度（C1），然后將不同濃度的樣本各分10份進行前處理，上機檢測，得到實際測定值（C2），將同時滿足偏移<15%、變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）<20%的濃度值定義為定量限。
1.3.4 攜帶污染
在評估攜帶污染時，先重復進樣低值（L）樣本（定量限濃度樣本），然后交替進樣高值（H）樣本（最高濃度的混合標準工作液）和低值樣本，按如下順序進樣：L1、L2、L3、H1、H2、L4、H3、H4、L5、L6、L7、L8、H5、H6、L9、H7、H8、L10、H9、H10、L11，比較第1次進樣的低值樣本后面跟隨的低值樣本檢測結果均值A（即L2、L3、L6、L7、L8的檢測均值）與隨后進樣的高值樣本后面跟隨的低值樣本檢測結果均值B（即L4、L5、L9、L10、L11的檢測均值）的差異。攜帶污染率=（B-A）/A×100%。若低于預定標準（20%），則認為在測定該高值及以下濃度時不存在明顯的攜帶污染。
1.3.5 正確度
采用加標回收實驗評估候選參考方法的正確度。用重量法分別將3個濃度梯度的混合標準溶液（他克莫司、西羅莫司、依維莫司低濃度均為100 ng/mL，中濃度均為500 ng/mL，高濃度均為1 000 ng/mL，環(huán)孢素A低、中、高濃度分別為1 000、5 000、10 000 ng/mL；用標準儲備液按重量法制備）和空白全血樣本按體積比1∶19制備3個濃度梯度的加標樣本（濃度1：他克莫司、西羅莫司、依維莫司濃度均為5 ng/mL，環(huán)孢素A濃度為50 ng/mL；濃度2：他克莫司、西羅莫司、依維莫司濃度均為25 ng/mL，環(huán)孢素A濃度為250 ng/mL；濃度3：他克莫司、西羅莫司、依維莫司濃度均為50 ng/mL，環(huán)孢素A濃度為500 ng/mL），每個濃度樣本重復測定5次，用加標回收率（測得量/加入量）考察候選參考方法的正確度，分別計算每個濃度加標樣本的回收率。
1.3.6 精密度
用加標的方式制備3個濃度梯度的質(zhì)控樣本（他克莫司、西羅莫司、依維莫司濃度分別為2.5、20、40 ng/mL；環(huán)孢素A濃度分別為25、200、400 ng/mL），每個濃度樣本重復測定5次，連續(xù)檢測3個批次，分別計算每個濃度質(zhì)控樣本的批內(nèi)CV和批間CV。
1.4 不確定度評估
2、結果
2.1 4種免疫抑制劑的校準曲線和線性范圍
2.2 候選參考方法的選擇性和特異性
2.3 基質(zhì)效應
2.4 定量限
2.5 攜帶污染率
2.6 正確度
2.7 精密度
2.8 不確定度評定
3、討論
他克莫司、西羅莫司、依維莫司和環(huán)孢素A均可與紅細胞結合，藥物在紅細胞和血漿之間的濃度比例超過30∶1，因此乙二胺四乙酸抗凝全血是最常用的樣本基質(zhì)，然而，全血樣本基質(zhì)復雜，實現(xiàn)精準定量，就必須對整個檢測流程的各個環(huán)節(jié)進行優(yōu)化。LC-MS/MS檢測全血樣本他克莫司、西羅莫司、依維莫司、環(huán)孢素A的過程涉及3個關鍵步驟：樣本前處理、色譜條件和質(zhì)譜條件。在樣本前處理過樣本時，由于全血樣本黏度比較大，且均勻性較差，本研究將全血樣本先-80 ℃冰凍至少10 min，然后平衡至室溫，以保證充分溶血，從而將目標分析物從紅細胞中分離出來，經(jīng)凍融后的樣本均勻性優(yōu)于未經(jīng)凍融處理的樣本。本研究對蛋白沉淀劑中硫酸鋅的濃度和硫酸鋅與甲醇的比例進行優(yōu)化，以達到最佳的蛋白沉淀效率；最后將高速離心后的上清液進行過濾，以減少基質(zhì)的影響，從而得到純凈的進樣樣本，整個處理過程簡單、省時。在色譜條件的選擇上，本研究對色譜柱、流動相、柱溫、流速、梯度洗脫程序進行了優(yōu)化，在保證分析靈敏度的同時，減小了各種內(nèi)源性干擾物質(zhì)對目標分析物的影響。質(zhì)譜條件的優(yōu)化主要包括目標分析物母離子/子離子的選擇、電壓和碰撞能量的優(yōu)化、離子源參數(shù)優(yōu)化，使每個目標分析物都具有穩(wěn)定且最佳的響應，確保檢測性能的穩(wěn)定可靠。
本研究參照相關文獻對建立的候選參考方法進行分析性能驗證。在建立方法時，所有的溶液配制和樣本移取均采用重量法。建立的候選參考方法檢測環(huán)孢素A的線性范圍為10～500 ng/mL，檢測他克莫司、西羅莫司和依維莫司的線性范圍為1～50 ng/mL；環(huán)孢素A的定量限為10 ng/mL，他克莫司、西羅莫司和依維莫司的定量限為1 ng/mL；定量限和線性范圍完全能夠滿足常規(guī)檢測的要求；相對基質(zhì)效應≤8.64%，證實了同位素內(nèi)標能夠校正基質(zhì)效應的影響。本研究精密度評價結果顯示，不同濃度下的4種免疫抑制劑的批內(nèi)CV和批間CV均<5%；環(huán)孢素A 3個濃度梯度的加標樣本回收率平均為98.84%～100.56%，他克莫司、西羅莫司和依維莫司平均為99.04%～100.99%，精密度和正確度完全能夠滿足參考測量程序的要求。
參考文獻（略）
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