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摘要

早期診斷和個(gè)體化精準(zhǔn)治療是提高腫瘤患者生存率、改善生活質(zhì)量和延長(zhǎng)生存期的關(guān)鍵。近年來(lái)，隨著液體活檢技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的新型腫瘤標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)，在腫瘤診斷、預(yù)后判斷和治療監(jiān)測(cè)等方面表現(xiàn)出較大的潛力，并且部分指標(biāo)已應(yīng)用于臨床實(shí)踐。未來(lái)研究應(yīng)重點(diǎn)解決阻礙新型腫瘤標(biāo)志物實(shí)現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化的難題，促使更多具有臨床應(yīng)用前景的液體活檢指標(biāo)能夠優(yōu)化腫瘤患者的診療過(guò)程，從而減輕患者疾病負(fù)擔(dān)。

關(guān)鍵詞

腫瘤標(biāo)志物; 循環(huán)腫瘤細(xì)胞; 循環(huán)腫瘤DNA甲基化; 非編碼RNA; 細(xì)胞外基質(zhì)

液體活檢是一種具有動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)優(yōu)勢(shì)的微創(chuàng)檢測(cè)手段，可分析體液循環(huán)中的腫瘤特異性標(biāo)志物，在臨床腫瘤患者的診療過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。然而，現(xiàn)有的腫瘤標(biāo)志物在腫瘤患者早期篩查、風(fēng)險(xiǎn)分層和個(gè)體化精準(zhǔn)治療等方面存在特異性低、時(shí)效性差等缺點(diǎn)。因此，臨床迫切需要表現(xiàn)更加出色的循環(huán)腫瘤標(biāo)志物，以幫助其在面對(duì)上述問(wèn)題時(shí)進(jìn)行科學(xué)、合理的決策。近年來(lái)，循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell，CTC）、循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）甲基化、非編碼RNA和細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)分子等新型腫瘤標(biāo)志物受到廣泛關(guān)注。這些指標(biāo)雖然在早期腫瘤檢測(cè)、預(yù)后評(píng)估、治療和復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)等方面具有超越現(xiàn)有生物標(biāo)志物的潛能，但在將其應(yīng)用于臨床實(shí)踐之前，必須克服生物學(xué)功能和檢測(cè)技術(shù)等方面的諸多限制。本文將對(duì)新型腫瘤標(biāo)志物在臨床應(yīng)用中的前景和挑戰(zhàn)進(jìn)行分析、討論，并針對(duì)現(xiàn)有方法提出可能的改進(jìn)思路，以期為臨床研究提供參考。

1　CTC

CTC是從原發(fā)腫瘤病灶脫落至外周血循環(huán)系統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞。利用液體活檢對(duì)腫瘤患者的CTC進(jìn)行檢測(cè)，可作為預(yù)后判斷和治療監(jiān)測(cè)的有效手段。目前，CTC作為腫瘤標(biāo)志物的臨床應(yīng)用研究主要集中于CTC計(jì)數(shù)和CTC分子表達(dá)譜分析2個(gè)方面。

外周血CTC計(jì)數(shù)在以下3個(gè)方面已取得了重要進(jìn)展：1）轉(zhuǎn)移性復(fù)發(fā)的預(yù)后評(píng)估和風(fēng)險(xiǎn)估計(jì)。2）治療效果評(píng)估和精準(zhǔn)醫(yī)療的用藥指導(dǎo)。3）藥物治療期間的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。CellSearch是一種商業(yè)化CTC計(jì)數(shù)系統(tǒng)，基于該系統(tǒng)的大量臨床試驗(yàn)證實(shí)了CTC計(jì)數(shù)在轉(zhuǎn)移預(yù)測(cè)中的價(jià)值，目前已被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于乳腺癌、結(jié)直腸癌和前列腺癌患者的臨床預(yù)后監(jiān)測(cè)中。此外，基于5項(xiàng)獨(dú)立隨機(jī)臨床試驗(yàn)的研究結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)移性前列腺癌治療中，利用 CTC計(jì)數(shù)變化預(yù)測(cè)藥物療效比前列腺特異性抗原更準(zhǔn)確。

除利用CTC計(jì)數(shù)監(jiān)測(cè)腫瘤發(fā)展外，目前臨床更加重視從CTC中獲取更多的細(xì)胞和分子生物學(xué)信息。有學(xué)者建立了一種監(jiān)測(cè)放療患者CTC中細(xì)胞程序性死亡-配體1（programmed cell death ligand 1，PD-L1）表達(dá)的方法，用于評(píng)估腫瘤免疫激活狀態(tài)，結(jié)果顯示，CTC中的 PD-L1水平與放療患者預(yù)后不良相關(guān)。此種動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)有2種策略：1）直接從分離的微量CTC中提取蛋白質(zhì)、DNA、RNA和代謝物進(jìn)行分析。2）體外培養(yǎng)獲得大量衍生CTC，分析其生物學(xué)特性。第1種策略保留了原腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性，但細(xì)胞較少、分析困難。第2種策略細(xì)胞數(shù)量大，分析準(zhǔn)確、全面，但CTC增殖后的分子水平變化可能會(huì)產(chǎn)生一定的不確定性。

在臨床應(yīng)用方面，以CellSearch為代表的CTC計(jì)數(shù)檢測(cè)系統(tǒng)有望在臨床推廣，用于腫瘤患者療效評(píng)估和復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)等。雖然CTC分離和計(jì)數(shù)存在設(shè)備昂貴、操作復(fù)雜的缺點(diǎn)，但總體臨床應(yīng)用前景良好。此外，CTC分子表達(dá)譜分析在臨床轉(zhuǎn)化中面臨諸多挑戰(zhàn)，需解決以下關(guān)鍵問(wèn)題：1）改進(jìn)現(xiàn)有CTC分離策略，在識(shí)別CTC的同時(shí)保持其細(xì)胞活力。2）開(kāi)發(fā)適用于臨床的單細(xì)胞蛋白質(zhì)、核酸和代謝物分析技術(shù)。3）改良CTC離體培養(yǎng)技術(shù)，可通過(guò)腫瘤患者衍生的CTC細(xì)胞系對(duì)其進(jìn)行校準(zhǔn)。

2　ctDNA甲基化

ctDNA是一種存在于體液中無(wú)細(xì)胞狀態(tài)的胞外DNA，通常來(lái)源于壞死或凋亡的腫瘤細(xì)胞、微轉(zhuǎn)移灶，或由CTC裂解釋放產(chǎn)生。DNA甲基化是目前被研究較多的表觀遺傳修飾之一，主要發(fā)生在CpG二核苷酸中，異常的DNA甲基化可促使腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。ctDNA的甲基化模式與其來(lái)源腫瘤細(xì)胞一致，因此具有作為腫瘤標(biāo)志物的潛在價(jià)值。與其他標(biāo)志物相比，ctDNA甲基化具有以下優(yōu)勢(shì)：1）DNA甲基化發(fā)生在腫瘤早期，具有組織和腫瘤類型特異性。2）腫瘤細(xì)胞基因組DNA甲基化變化廣泛、一致性強(qiáng)，因此可對(duì)ctDNA的多個(gè)CpG位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，檢出率高。3）DNA甲基化模式通常與特定腫瘤的起源相關(guān)，可用于揭示原發(fā)灶不明腫瘤的組織溯源。

近年來(lái)，眾多學(xué)者采用甲基化測(cè)序等方法證實(shí)，不同ctDNA甲基化在多種惡性腫瘤中具有作為早期診斷、療效監(jiān)測(cè)和預(yù)后判斷標(biāo)志物的潛在價(jià)值。美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局于2016年批準(zhǔn)了Epi proColon用于結(jié)直腸癌早期篩查，這是一種基于檢測(cè)SEPT9基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)的產(chǎn)品。我國(guó)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)了肺泡灌洗液SHOX2和RASSF1A基因甲基化檢測(cè)，用于肺癌的輔助診斷。然而，目前獲批的ctDNA甲基化檢測(cè)試劑均基于熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)方法，檢測(cè)靈敏度有限。

因此，ctDNA甲基化指標(biāo)作為腫瘤標(biāo)志物應(yīng)用于臨床，需要克服以下主要技術(shù)難點(diǎn)：1）在腫瘤負(fù)荷較低的情況下，提高ctDNA甲基化檢測(cè)的靈敏度是關(guān)鍵。2）ctDNA特定基因的甲基化檢測(cè)成本較低，但覆蓋率和準(zhǔn)確性不理想；全基因組甲基化測(cè)序則與之相反，未來(lái)如果能夠降低測(cè)序成本，可能是解決該問(wèn)題的有效途徑。3）需規(guī)范樣本分析前的質(zhì)量控制，建立標(biāo)準(zhǔn)化操作程序，以提高檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性和可比性。

3　非編碼RNA

非編碼RNA主要包括微小RNA（microRNA，miRNA）、環(huán)狀RNA（circle RNA，circRNA）和長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）。miRNA由19~24個(gè)核苷酸組成，主要參與調(diào)節(jié)細(xì)胞發(fā)育、分化、增殖、凋亡和代謝。circRNA具有共價(jià)閉環(huán)結(jié)構(gòu)，能抵抗核糖核酸酶的水解，在體內(nèi)比線性RNA更穩(wěn)定，可參與癌細(xì)胞增殖、侵襲和維持干性狀態(tài)等。lncRNA是一類長(zhǎng)度約為200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄后或翻譯水平調(diào)控基因表達(dá)和表觀遺傳，與腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、預(yù)后和耐藥相關(guān)。以上3種非編碼RNA均可由腫瘤組織直接或以外泌體的方式釋放至外周血，在多種惡性腫瘤中具有作為早期診斷、預(yù)后判斷和治療監(jiān)測(cè)標(biāo)志物的潛能。

非編碼RNA作為腫瘤標(biāo)志物的優(yōu)勢(shì)在于：1）應(yīng)用廣泛，血液、尿液、胸腔積液等樣本均可檢測(cè)。2）具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性，可抵抗高溫、極端pH值和長(zhǎng)期凍存等不利條件。3）非編碼RNA的檢測(cè)方法是實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR），該技術(shù)成熟、耗時(shí)少、成本低。然而，非編碼RNA也存在一定的缺點(diǎn)：1）某些非編碼RNA缺乏特異性，如外周血miR-21水平升高與前列腺癌、胃癌、肺癌，甚至炎癥均有關(guān)。2）結(jié)果的復(fù)現(xiàn)性較差，針對(duì)同一非編碼RNA的不同研究會(huì)出現(xiàn)不一致，甚至相反的結(jié)果，這可能與樣本量、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法、檢測(cè)方法的特異性等有關(guān)。鑒于以上缺點(diǎn)，非編碼RNA進(jìn)入臨床轉(zhuǎn)化階段尚面臨較大挑戰(zhàn)。由于某些非編碼RNA在腫瘤的輔助診斷和預(yù)后判斷等方面明顯優(yōu)于傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物，因此大量針對(duì)非編碼RNA的臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行。如能建立評(píng)估非編碼RNA的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，包括樣本的選擇、RNA抽提、檢測(cè)和標(biāo)準(zhǔn)化方法的統(tǒng)一等，非編碼RNA將有望用于臨床實(shí)踐。

4　細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM） 相關(guān)分子討論

腫瘤微環(huán)境在腫瘤惡性進(jìn)展中具有關(guān)鍵作用。ECM是腫瘤微環(huán)境的主要成分之一，是由蛋白質(zhì)、糖蛋白、蛋白聚糖和多糖等成分組成的復(fù)雜混合物。腫瘤發(fā)生時(shí)ECM會(huì)重塑，改變微環(huán)境的生化和力學(xué)特性，促使惡性進(jìn)展和治療抵抗。ECM重塑后其成分釋放至外周血，可作為腫瘤診斷或預(yù)后判斷的潛在標(biāo)志物。

具有作為腫瘤標(biāo)志物潛能的ECM成分主要包括以下4類：1）基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP），目前臨床研究較多的是MMP-7和MMP-9，二者在乳腺癌、結(jié)直腸癌、肺癌和泌尿系統(tǒng)腫瘤等中具有輔助診斷和預(yù)后判斷的潛在價(jià)值。2）膠原（collagen，COL），COL1、COL3和COL4的降解產(chǎn)物是輔助診斷乳腺癌、結(jié)直腸癌和胰腺癌的潛在血清學(xué)指標(biāo)，同時(shí)與患者不良預(yù)后相關(guān)；COL18A1則在肺癌、結(jié)直腸癌和胰腺癌的診斷中發(fā)揮一定作用。3）糖蛋白，主要為層粘連蛋白和骨橋蛋白，層粘連蛋白可輔助診斷乳腺癌和胰腺癌，骨橋蛋白與肺癌和胰腺癌患者的不良預(yù)后相關(guān)。4）透明質(zhì)酸（hyaluronan，HA），HA降解產(chǎn)物可輔助診斷乳腺癌和結(jié)直腸癌，并具有監(jiān)測(cè)術(shù)后療效和復(fù)發(fā)的潛能。

腫瘤細(xì)胞之間存在的異質(zhì)性會(huì)對(duì)基于可溶性腫瘤相關(guān)分子檢測(cè)方法的臨床應(yīng)用造成一定的阻礙，而腫瘤間質(zhì)ECM分子的檢測(cè)可能是彌補(bǔ)上述不足的可行方法。因此，ECM分子與腫瘤細(xì)胞特征相關(guān)標(biāo)志物，如糖類抗原（carbohydrate antigen，CA）125、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、CA15-3等相結(jié)合，將是具有臨床應(yīng)用前景的腫瘤診斷及治療后隨訪策略。然而，ECM分子作為腫瘤標(biāo)志物應(yīng)用于臨床仍面臨較多挑戰(zhàn)：1）ECM分子具有良好的診斷及預(yù)后判斷價(jià)值，但在不同腫瘤中缺乏特異性，必須結(jié)合其他腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行綜合判斷。2）目前，ECM分子的檢測(cè)方法以酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)為主，操作復(fù)雜、通量低、耗時(shí)長(zhǎng)，難以滿足臨床大樣本篩查的要求。3）在選擇ECM分子作為腫瘤標(biāo)志物時(shí)，不僅應(yīng)關(guān)注其表達(dá)水平的改變，更要關(guān)注其是否發(fā)生特異性改變（如降解片段、蛋白酶活性改變）。

5　總結(jié)

生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和創(chuàng)新為新型腫瘤標(biāo)志物的開(kāi)發(fā)提供了新的契機(jī)。雖然目前只有少數(shù)新型液體活檢指標(biāo)獲批可應(yīng)用于臨床，但CTC、ctDNA甲基化、非編碼RNA和ECM分子等標(biāo)志物在腫瘤患者診療過(guò)程中已經(jīng)展示出良好的臨床應(yīng)用前景。現(xiàn)今的難點(diǎn)在于這些標(biāo)志物在臨床轉(zhuǎn)化中要克服諸多困難，主要為技術(shù)難度大、特異性較低、缺乏標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)程。如果能夠解決上述難題，新型液體活檢標(biāo)志物將發(fā)揮其動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)的優(yōu)勢(shì)，為腫瘤患者早期診斷和個(gè)體化精準(zhǔn)治療作出重要貢獻(xiàn)。

參考文獻(xiàn)（略）