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不一樣的逆轉(zhuǎn)錄-熱啟動(dòng)與耐高溫

更新時(shí)間：2023/5/8 14:45:24　瀏覽次數(shù)：8206

不一樣的逆轉(zhuǎn)錄 ———— 熱啟動(dòng)與耐高溫

研究表明雙鏈核酸的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性依次為RNA:RNA> RNA:DNA>DNA:DNA (Biochemistry, Vol. 34, No. 34, 1995)，對(duì)于普通單鏈RNA的逆轉(zhuǎn)錄，引物正常與RNA靶標(biāo)退火，通過常規(guī)逆轉(zhuǎn)錄酶即可完成cDNA的合成，但是具有雙鏈或二級(jí)結(jié)構(gòu)的RNA其特殊的穩(wěn)定性則阻礙了DNA引物與靶標(biāo)的結(jié)合，導(dǎo)致逆轉(zhuǎn)錄效率降低。因此這給進(jìn)行雙鏈RNA的RT-qPCR檢測(cè)或測(cè)序分析帶來了問題：

For example:

問題：

➡ 為什么有些RNA靶標(biāo)的RT-qPCR引物設(shè)計(jì)篩選較困難？

➡ 為什么總RNA的cDNA合成存在一定的偏倚性？

為解決這些問題，提高雙鏈RNA和具有二級(jí)結(jié)構(gòu)RNA的檢測(cè)效果，通常有以下三種解決方案：

For example:

方案：

➡ 采用修飾的引物，提升引物與RNA結(jié)合的穩(wěn)定性

➡ 熱穩(wěn)定的逆轉(zhuǎn)錄酶，高溫打開RNA雙鏈

➡ RNAseH酶靶向水解部分RNA鏈

或者在逆轉(zhuǎn)錄開始之前先加入模板和引物，高溫變性之后進(jìn)行引物退火，再加入逆轉(zhuǎn)錄酶體系。但顯然該方法會(huì)增加操作步驟，使流程更為繁瑣增加人工錯(cuò)誤的風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)也也不能從根本上解決隨機(jī)引物退火時(shí)的偏好性。

那么，針對(duì)這些問題與不甚完善的解決方案，我們真的束手無策了嗎？答案是：不！并且，讓我們把目光轉(zhuǎn)向不一樣的逆轉(zhuǎn)錄：

修飾引物解決方案示例

如下圖所示，OxyS RNA 存在多處發(fā)卡結(jié)構(gòu)，當(dāng)設(shè)計(jì)引物從3‘末端進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄時(shí)，根據(jù)電泳條帶，DNA引物無法與靶標(biāo)退火形成雙鏈復(fù)合物，而當(dāng)DNA引物部分堿基替換為L(zhǎng)NA后，由于Tm值的提升，可成功與靶標(biāo)RNA結(jié)合，進(jìn)而完成逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（Biochemistry 2009, 48, 514–516）。

熱啟動(dòng)高溫逆轉(zhuǎn)錄解決方案示例

自然界中存在多種雙鏈RNA病毒具有人畜致病性，如輪狀病毒是引起6個(gè)月~2歲嬰幼兒嚴(yán)重胃腸炎的主要病原體，占病毒性胃腸炎的80%以上。

在過去的一年我們成功推出了一款具有變革意義的RT-qPCR預(yù)混液，當(dāng)市場(chǎng)目光聚焦在可凍干、樣本直擴(kuò)的同時(shí)，我們針對(duì)RT-qPCR中逆轉(zhuǎn)錄酶無法耐受高溫的局限進(jìn)行了革命性的改進(jìn)，使得全新的一步法RT-qPCR預(yù)混液逆轉(zhuǎn)錄前可耐受85℃高溫，具有獨(dú)特的熱激活逆轉(zhuǎn)錄功能，且在60℃-80℃之間保持同樣優(yōu)秀的逆轉(zhuǎn)錄活性。

以上特性可以更好的幫助客戶避免非特異性擴(kuò)增、更好的應(yīng)對(duì)復(fù)雜RNA模板如二級(jí)結(jié)構(gòu)和雙鏈RNA病毒、實(shí)現(xiàn)更快的檢測(cè)速度。

為了驗(yàn)證該預(yù)混液針對(duì)雙鏈RNA病毒檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)，我們進(jìn)行了如下實(shí)驗(yàn)。以A型輪狀病毒（呼腸孤病毒科）分離的雙鏈RNA（dsRNA）為模板，與競(jìng)爭(zhēng)對(duì)手C進(jìn)行比較。輪狀病毒dsRNA在每個(gè)反應(yīng)中連續(xù)稀釋50000–5個(gè)拷貝，每個(gè)靶點(diǎn)濃度下重復(fù)6次。結(jié)果如圖所示，相比于競(jìng)爭(zhēng)對(duì)手，我們對(duì)于低拷貝模板具有更高的檢出率。能夠很好的幫助客戶實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品性能的進(jìn)一步提升。