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      人類腸道病毒71型 (EV71) 是手足口病 (HFMD) 的主要病原體之一，偶爾會引起嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥。有臨床證據(jù)表明，EV71感染會增加嚴重手足口病患者血清中的外泌體，提示外泌體在EV71發(fā)病機制中的作用，但其功能尚未完全闡明。 

　　為了深入探究外泌體在EV71感染中的作用，2022年10月5日暨南大學病原微生物研究院羅震課題組在Frontiers in Microbiology上發(fā)表了題為“Enterovirus 71 non-structural protein 3A hijacks vacuolar protein sorting 25 to boost exosome biogenesis to facilitate viral replication”的研究。該研究發(fā)現(xiàn)EV71感染細胞誘導外泌體分泌增加，并找到EV71 3A蛋白與宿主Vacuolar protein sorting 25 (VPS25) 蛋白相互作用，促進外泌體分泌。進一步利用 siRNA沉默技術和外泌體生物發(fā)生抑制劑實驗，揭示VPS25介導的外泌體產(chǎn)生可促進EV71感染。暨南大學病原微生物研究院2018級碩士阮志慧和2020級博士生梁藝聰為論文的共同第一作者，暨南大學病原微生物研究院羅震副研究員和吳建國教授為共同通訊作者。研究得到了國家自然科學基金等項目支持。 

　　圖1：腸道病毒 71 (EV71) 感染促進外泌體生物發(fā)生 

　　該研究首先提取EV71感染的細胞上清液中的外泌體，通過透射電子顯微鏡 (TEM) 分析觀察到提取的細胞外囊泡具有典型的外泌體結(jié)構。并通過NTA測量外泌體的直徑和顆粒數(shù)，同時對其蛋白質(zhì)濃度進行測量。結(jié)果表明，EV71感染細胞分泌的外泌體的顆粒數(shù)量和蛋白質(zhì)濃度均顯著高于未感染細胞。通過蛋白質(zhì)印跡法進一步驗證提取的外泌體中標志物 HRS、Tsg101、CD9 和 CD63 蛋白的含量。作者進一步在外泌體上使用膜染料Dil和熒光團偶聯(lián)的CD9抗體進行了免疫染色，顯示外泌體被Dil特異性染色，并與CD9蛋白共定位。 

　　圖2：EV71 3A蛋白與VPS25相互作用 

　　通過前期篩選，作者發(fā)現(xiàn)EV71的非結(jié)構蛋白可特異性地促進外泌體產(chǎn)生。在表達的GFP或GFP-3A蛋白細胞裂解物中，作者使用GFP抗體進行了免疫沉淀，通過 SDS-PAGE分離可能與3A蛋白相互作用的細胞蛋白。接下來，Co-IP分析、免疫熒光共定位分析和雙分子熒光互補測定實驗顯示VPS25可以和3A蛋白相互作用。提示3A蛋白與VPS25相互作用促進外泌體的產(chǎn)生。 

　　圖3：VPS25蛋白介導EV71誘導的外泌體產(chǎn)生 

　　隨后，通過siRNA沉默技術敲低VPS25蛋白表達，發(fā)現(xiàn)siVPS25-1#可顯著降低EV71 3A蛋白過表達和EV71感染誘導的外泌體產(chǎn)生，說明VPS25蛋白介導EV71誘導的外泌體產(chǎn)生。 

　　圖4：VPS25介導 EV71 誘導的外泌體以促進病毒復制 

　　論文的最后，作者探討了VPS25介導的外泌體在EV71生活周期的影響。在EV71感染后8和12 h的早期階段，相對于siNC，用siVPS25-1# 轉(zhuǎn)染的細胞中病毒蛋白VP1和3A的表達不受影響；當EV71感染細胞達24 h時，病毒蛋白VP1和3A的病毒表達顯著降低，表明在第一輪感染后抑制細胞內(nèi)EV71復制。在平行實驗中，siVPS25-1#顯著降低了后代EV71的滴度。此外，當細胞以劑量依賴性方式轉(zhuǎn)染 siVPS25-1# 時，EV71誘導的細胞毒性顯著降低。結(jié)果說明，VPS25介導 EV71 誘導的外泌體可促進病毒復制。 

　　圖5：GW4869通過抑制EV71誘導的外泌體生物產(chǎn)生來抑制病毒復制 

　　類似地，考慮到GW4869是一種外泌體生物發(fā)生/釋放抑制劑，它靶向內(nèi)吞途徑中的nSMase以調(diào)節(jié)外泌體生物發(fā)生。在細胞裂解物中，GW4869不影響Calnexin、HRS、Tsg101、CD9、CD63 和VPS25的內(nèi)源性表達。在外泌體中，EV71增加了VPS25的蛋白水平以及HRS、Tsg101、CD9 和 CD63，而這種誘導在GW4869存在下顯著降低。在EV71感染后，GW4869存在下，細胞EV71 3A蛋白表達量明顯降低。 

　　在8和12 h后，GW4869不影響EV71 VP1蛋白的表達，說明GW4869對早期EV71胞內(nèi)復制沒有明顯影響。在24 h后，在EV71感染后用GW4869處理的細胞中，病毒蛋白VP1和3A的表達被顯著抑制，同時，GW4869明顯降低了子代EV71的滴度。此外，當細胞以劑量依賴性方式暴露于GW4869 時，EV71誘導的細胞毒性顯著降低。這進一步證實，抑制 EV71 誘導的外泌體，可有效地抑制病毒復制。 

　　圖6：EV71調(diào)控外泌體產(chǎn)生，促進病毒復制模式圖 

　　幾乎所有感染病毒的細胞都可以釋放外泌體，這在病毒感染中起著重要作用。本研究揭示了EV71利用外泌體生成途徑并與 ESCRT 復合蛋白相互作用以增強病毒復制過程。值得注意的是，除了外泌體，一些細胞外囊泡群（特別是大小> 200 nm）在病毒復制中也有一定的作用。外泌體和其他細胞外囊泡中參與EV71 復制的因素需要在未來的工作中加以闡明。