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文章來(lái)源：中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志, 2022,45(4) : 428-432

作者：李錦潮 肖斌 宣俊峰 孫朝暉 李林海

摘要

多重核酸檢測(cè)技術(shù)具有可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)靶標(biāo)、高通量、低成本等優(yōu)勢(shì)，滿足大規(guī)模篩查、定量等檢測(cè)需求。多重聚合酶鏈反應(yīng)廣泛應(yīng)用于病原體、甲基化DNA和突變基因檢測(cè)以及單核苷酸多態(tài)性分型；重組聚合酶擴(kuò)增、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增等等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在即時(shí)檢測(cè)領(lǐng)域有很好的前景；基于規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列（CRISPR）/CRISPR相關(guān)蛋白（Cas）系統(tǒng)的多重核酸檢測(cè)技術(shù)因其高靈敏度、高特異性成為新的研究熱點(diǎn)；而宏基因測(cè)序在新發(fā)病原體突變監(jiān)測(cè)和腫瘤學(xué)研究等領(lǐng)域發(fā)揮主導(dǎo)作用。本文對(duì)各種多核酸檢測(cè)技術(shù)的臨床應(yīng)用現(xiàn)狀及未來(lái)發(fā)展方向進(jìn)行論述。

多重核酸檢測(cè)技術(shù)是指在同一反應(yīng)管中同時(shí)進(jìn)行多個(gè)核酸靶標(biāo)擴(kuò)增與檢測(cè)的技術(shù)，基于核酸擴(kuò)增與檢測(cè)原理，主要分為多重聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）、多重等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（isothermal amplification technology，ITA）、基于規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列/相關(guān)蛋白（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein，CRISPR/Cas）的多重核酸檢測(cè)技術(shù)以及宏基因組測(cè)序（metagenomics next generation sequencing，mNGS）。不同檢測(cè)技術(shù)各有優(yōu)勢(shì)，其檢測(cè)原理和應(yīng)用場(chǎng)景也各具特點(diǎn)（表1）。

一、多重PCR

多重PCR是臨床應(yīng)用最廣泛的多重核酸檢測(cè)技術(shù)，目前主要用于細(xì)菌、病毒的檢測(cè)與定量、單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）分型、疾病突變基因、啟動(dòng)子甲基化的檢測(cè)。其基本原理是在同一PCR反應(yīng)體系中加入多對(duì)特異性引物，同時(shí)擴(kuò)增、檢測(cè)多個(gè)目的基因。Chamberlain等［1］報(bào)道多重PCR時(shí)就已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了6重?cái)U(kuò)增，ThermoFisher公司的多重PCR試劑盒能實(shí)現(xiàn)20重?cái)U(kuò)增；PrimerPlex、iCubate2.0等軟件可以實(shí)現(xiàn)多重PCR引物與探針的設(shè)計(jì)與優(yōu)化，從而降低非特異性擴(kuò)增的可能。本章主要介紹各種熒光定量檢測(cè)方法。

（一）TaqMan探針

TaqMan探針能夠與靶序列互補(bǔ)結(jié)合，在PCR反應(yīng)延伸階段被Taq酶水解使其5′端的熒光基團(tuán)與3′端的淬滅基團(tuán)分離，游離的熒光基團(tuán)在激發(fā)光作用下釋放特定波長(zhǎng)的熒光信號(hào)�；�于TaqMan探針的多重PCR臨床應(yīng)用的意義多樣。主流的新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑盒可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)靶點(diǎn)以避免因基因突變或核酸降解造成假陰性［2］，也可同時(shí)檢測(cè)靶標(biāo)與管家基因，以實(shí)現(xiàn)病原體的相對(duì)定量［3］；或者用于精確區(qū)分臨床癥狀相似的感染性病原體［4］。典型TaqMan探針不能識(shí)別單堿基突變，而核酸類似物鎖核酸（locked nucleic acid，LNA）和小溝結(jié)合物（minor groove binder，MGB）均能縮短探針長(zhǎng)度、提高探針Tm值，使其具有識(shí)別單堿基錯(cuò)配的能力。Zhao等［5］基于TaqMan-LNA探針建立了結(jié)核分枝桿菌多重RT-qPCR檢測(cè)體系，實(shí)現(xiàn)了對(duì)利福平耐藥基因單堿基突變的識(shí)別；Xue等［6］利用TaqMan-MGB探針設(shè)計(jì)了3組雙重PCR，能準(zhǔn)確識(shí)別出人線粒體多個(gè)單堿基突變位點(diǎn)。

（二）分子信標(biāo)

分子信標(biāo)是一種非水解寡核苷酸探針，其熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)相互靠近不產(chǎn)生熒光信號(hào)；當(dāng)分子信標(biāo)與靶標(biāo)互補(bǔ)結(jié)合后自身構(gòu)象發(fā)生變化，使熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，在相應(yīng)激發(fā)光作用下釋放特定的熒光信號(hào)。分子信標(biāo)能夠識(shí)別單堿基突變，可用于SNP分型和熔解曲線分析［7］。分子信標(biāo)的背景熒光極低，PCR體系中同時(shí)存在10多種分子信標(biāo)依舊有很好的檢測(cè)效能。Chakravorty等［8］利用分子信標(biāo)多重PCR，開(kāi)發(fā)了能同時(shí)檢測(cè)多重耐藥結(jié)核分枝桿菌rrs、inhA、gyrA1、eis2等9個(gè)耐藥基因以及1個(gè)擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的10重檢測(cè)體系，檢測(cè)極限達(dá)到300 CFU。Marras等［9］將FAM、TET、Alexa-594、Alexa-568等6種熒光基團(tuán)組成15對(duì)獨(dú)特的分子信標(biāo)組合，實(shí)現(xiàn)對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌、肺炎鏈球菌、肺炎克雷伯桿菌等15種病原體特異性基因質(zhì)粒的15重檢測(cè)。

（三）HRM分析

HRM分析是基于非特異性雙鏈DNA結(jié)合染料的熒光定量PCR，通過(guò)熔解曲線形狀和峰值位置的微小差異來(lái)區(qū)分不同靶標(biāo)，從而實(shí)現(xiàn)多重核酸檢測(cè)。該方法無(wú)需特異性探針、標(biāo)記引物以及二次開(kāi)管等。HRM分析需要使用飽和的DNA染料，有研究表明，非特異性雙鏈核酸染料SYBR Green Ⅰ濃度變化會(huì)影響熔解曲線形狀和靶標(biāo)熔解溫度（melting temperature，Tm），當(dāng)濃度高于2 μmol/L時(shí)會(huì)明顯抑制PCR反應(yīng)，而SYTO9濃度在0.5~10 μmol/L范圍內(nèi)均未出現(xiàn)明顯的抑制作用，其濃度變化也不影響熔解峰的形狀與位置［10］。因此HRM分析常使用SYTO、LCGreen等無(wú)堿基偏好性、PCR擴(kuò)增抑制不明顯且精密度好的核酸染料［11］。HRM常用于SNP分析、等位基因純雜合子鑒別、基因突變和啟動(dòng)子甲基化水平檢測(cè)［12］。Salviato等［13］利用HRM分析成功檢出血友病B患者F9基因堿基變異，精確識(shí)別出不同位點(diǎn)的堿基突變。

基于TaqMan探針的多重PCR已經(jīng)成為常規(guī)的感染性病原體核酸檢測(cè)方法。分子信標(biāo)探針主要用于基因篩查和SNP分型。HRM分析篩查突變基因的成本更低。然而傳統(tǒng)的PCR技術(shù)正面臨著NGS的挑戰(zhàn)。

二、等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

相較于PCR，等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)具有反應(yīng)迅速、檢測(cè)設(shè)備微型化、不依賴于溫度循環(huán)儀等多個(gè)優(yōu)點(diǎn)。本章節(jié)主要介紹多重RPA和多重LAMP的研究進(jìn)展和臨床應(yīng)用。

（一）多重RPA

RPA體系包括重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白和鏈置換DNA聚合酶3種基本的酶。RPA在37~42 ℃恒溫條件下反應(yīng)20~30 min即可完成核酸擴(kuò)增［14］，臨床上主要應(yīng)用于病原體的快速檢測(cè)。為了平衡多重RPA中各待測(cè)靶標(biāo)的擴(kuò)增速率，需要進(jìn)行引物對(duì)篩選并優(yōu)化引物濃度。研究表明，在引物的5′端附著一段通用引物序列后，可以一定程度上縮小各反應(yīng)間擴(kuò)增效率的差距［15］。RPA擴(kuò)增產(chǎn)物可通過(guò)熒光定量和側(cè)流層析試紙條檢測(cè)。

1. 多重?zé)晒舛�量RPA：Exo探針是多重?zé)晒舛�量RPA最常用的探針。Exo探針的核酸序列中含有四氫呋喃（tetrahydrofuran，THF）堿基位點(diǎn)，核酸兩端標(biāo)記有熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)。當(dāng)探針與靶序列互補(bǔ)結(jié)合后，核酸外切酶Ⅲ（exonuclease Ⅲ，Exo）能識(shí)別并切割THF位點(diǎn)使熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)的特異性檢測(cè)。Li等［16］基于Exo探針建立了腸病毒71型、柯薩奇病毒A16型以及擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的3重RT-RPA，以RT-qPCR為金標(biāo)準(zhǔn)，檢測(cè)腸病毒71型、柯薩奇病毒A16型的敏感度分別為92.3%、99.0%，特異度分別為99.7 %與100%。

2. 多重RPA側(cè)流層析試紙條法：此方法的基本原理是對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙標(biāo)記，再利用抗體-抗原反應(yīng)在試紙條不同位置捕獲特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。主流的試紙條法是向反應(yīng)體系中加入核酸外切酶Ⅳ（endonuclease Ⅳ，nfo）和帶有特異性基團(tuán)標(biāo)記的nfo探針，在nfo酶的作用下可形成特異性雙標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物。Sun等［17］基于此方法建立了檢測(cè)甲型流感病毒和乙型流感病毒的雙重RT-RPA，2種病毒的最低檢出限分別為500拷貝與50拷貝；Zhai等［18］在建立淋病奈瑟菌與沙眼衣原體兩重RPA體系時(shí)，直接將生物素與FAM標(biāo)記在前引物上，地高辛標(biāo)記后引物；并檢測(cè)79份病臨床樣本，兩種病原體的檢測(cè)敏感度分別為85.62%與90.90%。多重RPA側(cè)流層析試紙條法不依賴于熒光檢測(cè)裝置，可通過(guò)手握、腋窩夾持反應(yīng)管進(jìn)行加熱，但只能進(jìn)行半定量檢測(cè)，其靈敏度也弱于熒光檢測(cè)法。

3. 固相RPA：也稱芯片RPA，其基本原理是將擴(kuò)增反應(yīng)的一條引物固定在芯片或者數(shù)字視頻光盤(pán)DVD表面的特定區(qū)域，通過(guò)位置來(lái)區(qū)分不同擴(kuò)增反應(yīng)，因此可依靠化學(xué)發(fā)光法等手段進(jìn)行熒光檢測(cè)。此方法的優(yōu)點(diǎn)在于各區(qū)域的擴(kuò)增反應(yīng)相互獨(dú)立，引物固定在芯片表面也可減少二聚體形成。Kersting等［19］基于固相RPA建立了檢測(cè)金黃色葡萄球菌、腸道沙門(mén)菌、淋病奈瑟菌與擴(kuò)增內(nèi)參的4重RPA，3種細(xì)菌的最低檢出限分別為10拷貝、10拷貝與100拷貝。

目前，多重RPA主要應(yīng)用于食品衛(wèi)生、農(nóng)牧業(yè)等領(lǐng)域，其靈敏度低、定量能力較差，尚不能滿足乙型肝炎病毒等病原體的檢測(cè)需求。固相RPA則將核酸檢測(cè)體系一體化、模塊化，簡(jiǎn)化了反應(yīng)流程。

（二）多重LAMP

LAMP是由Notomi等［20］在2000年開(kāi)發(fā)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，在60~65 ℃下反應(yīng)30~60 min即可完成核酸擴(kuò)增。單個(gè)LAMP擴(kuò)增反應(yīng)需要2對(duì)或者3對(duì)引物，多重LAMP的引物數(shù)量成倍增加，容易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。目前尚未有能與LAMP反應(yīng)體系兼容的核酸外切酶或內(nèi)切酶，也缺乏成熟的特異性熒光檢測(cè)手段，主要通過(guò)反應(yīng)液渾濁度、顏色或者pH值變化等非特異性手段檢測(cè)LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物。

1. 多重?zé)晒舛�量LAMP：分子信標(biāo)在LAMP反應(yīng)體系中背景熒光強(qiáng)、缺乏特異性［21］，而Sherrill-Mix等［22］發(fā)現(xiàn)，在分子信標(biāo)核酸序列中加入多個(gè)核酸類似物L(fēng)NA后，能提高分子信標(biāo)莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，提高其與靶序列的結(jié)合力和檢測(cè)特異性。該團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)出檢測(cè)新型冠狀病毒小包膜糖蛋白基因與人唾液富酪蛋白基因的雙重LAMP，新型冠狀病毒最低檢出限達(dá)到125拷貝。Becherer等［23］開(kāi)發(fā)出媒介置換法：當(dāng)前環(huán)狀引物參與擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，結(jié)合在前環(huán)狀引物上的媒介序列會(huì)被置換下來(lái)，并與特異性探針互補(bǔ)結(jié)合，使探針變構(gòu)并釋放熒光信號(hào)。該團(tuán)隊(duì)利用此方法實(shí)現(xiàn)了梅毒螺旋體和杜克嗜血桿菌的雙重檢測(cè)。但此方法是通過(guò)引物消耗來(lái)表示擴(kuò)增反應(yīng)，并不能區(qū)分非特異性擴(kuò)增與特異性擴(kuò)增。

2. 多重LAMP側(cè)流層析試紙條法：Zhu等［24］將雙重RT-LAMP與側(cè)流層析試紙條結(jié)合，建立新冠病毒雙重檢測(cè)體系，分別用異硫氰酸熒光素與地高辛標(biāo)記ORF1ab與N基因的前環(huán)狀引物，用生物素標(biāo)記脫氧核糖核苷三磷酸，經(jīng)過(guò)LAMP擴(kuò)增形成異硫氰酸熒光素/地高辛加生物素雙標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物，生物素與顯色染料相結(jié)合，而異硫氰酸熒光素與地高辛分別被試紙條上相應(yīng)的抗體條帶所捕獲，從而實(shí)現(xiàn)雙重檢測(cè)。

三、基于CRISPR/Cas的多重核酸檢測(cè)技術(shù)

高靈敏度、高特異度的CRISPR/Cas核酸檢測(cè)技術(shù)有望取代PCR的傳統(tǒng)地位，在便攜式、即時(shí)檢測(cè)領(lǐng)域前景廣闊。

2017年Gootenberg等［25］將RPA、T7轉(zhuǎn)錄與Cas13a整合為SHERLOCK技術(shù)平臺(tái)，用于DNA或RNA快速檢測(cè)。該團(tuán)隊(duì)利用Cas13蛋白的“連帶剪切”偏好性，結(jié)合4種Cas13蛋白和AsCas12a開(kāi)發(fā)出5重核酸檢測(cè)技術(shù)SHERLOCKv2［26, 27］。Abudayyeh等［28］基于LwaCas13a、PsmCas13b實(shí)現(xiàn)對(duì)大豆草甘膦抗性基因CP4 EPSPS以及大豆管家基因LE1的雙重檢測(cè)。

Xiong等［29］基于雙重RT-RPA、CRISPR/Cas9以及側(cè)流層析試紙條構(gòu)建了檢測(cè)新型冠狀病毒E基因與ORF1ab基因的雙重RT-RPA。此團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)的單引導(dǎo)RNA（single guide RNA，sgRNA）既能與目標(biāo)序列特異性結(jié)合，也能與膠體金上的DNA探針結(jié)合，形成生物素或地高辛-擴(kuò)增子-Cas9/sgRNA-膠體金復(fù)合物，從而實(shí)現(xiàn)雙重檢測(cè)；利用該方法檢測(cè)64份新型冠狀病毒肺炎疑似患者的咽拭子樣本，與RT-qPCR相比，其陽(yáng)性符合率、陰性符合率分別達(dá)97.14%與100%。

在SHEROLOCKv2體系中，一些Cas13蛋白核酸檢測(cè)效率受CRISPR來(lái)源RNA（CRISPR-derived RNA，crRNA）序列影響，需要進(jìn)行crRNA篩選，增加了設(shè)計(jì)成本。此外，crRNA、sgRNA和探針需要-80 ℃保存，試劑運(yùn)輸儲(chǔ)存成本高，不合適在醫(yī)療資源匱乏的場(chǎng)景使用。

四、mNGS

mNGS能夠?qū)Υ郎y(cè)樣本中所有DNA或者RNA進(jìn)行無(wú)選擇性測(cè)序，在腫瘤與感染性疾病的臨床診斷中發(fā)揮重要作用。Papaemmanuil等［30］對(duì)1 540例急性髓性白血�。╝cute myelogenous leukemia，AML）患者的外周血進(jìn)行mNGS測(cè)序，分析突變位點(diǎn)頻率與疾病預(yù)后的相關(guān)性，繪制了AML的基因分型圖譜，從而更好地指導(dǎo)個(gè)性化治療。mNGS檢測(cè)成本相對(duì)較高，耗時(shí)長(zhǎng)，臨床上仍不能將其作為病原體的常規(guī)檢測(cè)手段，目前主要用于新發(fā)病原體和傳統(tǒng)方法難以檢出的感染性疾病病原體的快速檢測(cè)；中國(guó)疾病預(yù)防控制中心等機(jī)構(gòu)通過(guò)mNGS在新型冠狀病毒肺炎暴發(fā)初期便獲得新冠病毒全基因序列，為疾病的診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供了及時(shí)的證據(jù)［31］；Salzberg等［32］對(duì)10例疑似中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染但PCR和細(xì)菌培養(yǎng)無(wú)法確診的患者進(jìn)行mNGS測(cè)序后，明確了其中7例患者的感染情況，從而提高了中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性病原體的檢出率。

包括mNGS、RNA-seq在內(nèi)的新一代測(cè)序技術(shù)在臨床診斷和科學(xué)研究中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。隨著測(cè)序成本的降低、檢測(cè)時(shí)間的縮短以及生物信息分析的成熟，mNGS極有可能成為臨床病原微生物常規(guī)的檢驗(yàn)手段。

五、總結(jié)

基于TaqMan探針的多重PCR已成為病原體檢測(cè)、SNP分型、DNA甲基化等領(lǐng)域的重要檢測(cè)工具；分子信標(biāo)的低背景熒光使得其多重檢測(cè)效能優(yōu)于TaqMan探針；HRM作為一種高效低成本的單堿基識(shí)別方法，在快速低通量基因鑒定中的潛力較大。等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在即時(shí)便攜檢測(cè)領(lǐng)域優(yōu)勢(shì)明顯，但多重RPA的檢測(cè)靈敏度仍有待提高，多重LAMP則需要成熟的檢測(cè)方案。隨著測(cè)序成本的降低和檢測(cè)周期的縮短，mNGS很可能成為臨床實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)檢測(cè)技術(shù)。綜上所述，多核酸檢測(cè)技術(shù)的快速發(fā)展，將提供快速、簡(jiǎn)便、多元化的核酸檢測(cè)方案，極大提高疾病和病原微生物的檢測(cè)能力。