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　　病毒的入侵及釋放是決定病毒傳染性及致病性的重要因素。β冠狀病毒家族通過溶酶體外泌通路(lysosomal exocytosis)，將運(yùn)輸?shù)饺苊阁w的病毒顆粒釋放至宿主細(xì)胞外[1]。在溶酶體外泌的過程中，結(jié)合于溶酶體上的BORC-ARL8b復(fù)合物介導(dǎo)溶酶體在微管上的正向運(yùn)輸，即將溶酶體從細(xì)胞核方向運(yùn)輸至細(xì)胞膜附近，并通過溶酶體膜與細(xì)胞膜的融合而將溶酶體內(nèi)容物釋放至細(xì)胞外。該膜融合過程由包括STX4、VAMP7和SNAP23的SNARE復(fù)合體介導(dǎo)，并且這個(gè)過程需要細(xì)胞內(nèi)或局部鈣濃度的上調(diào)[2,3]。目前我們對于新冠蛋白如何調(diào)控溶酶體外泌所介導(dǎo)的病毒分泌機(jī)制知之甚少。 

　　β冠狀病毒家族如非典病毒(SARS-CoV)、新冠病毒(SARS-CoV 2)和鼠肝炎病毒(MHV)均為正鏈RNA病毒。SARS和新冠病毒利用其表面的刺突糖蛋白(Spike Glycoprotein, S蛋白)與細(xì)胞表面受體ACE2結(jié)合而進(jìn)入宿主細(xì)胞，重塑宿主細(xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵細(xì)胞器，以進(jìn)行病毒復(fù)制、裝配和釋放。相比與非典病毒，新冠病毒具有更高的傳染性和致病性。研究新冠病毒和非典病毒蛋白的功能差異，對于我們認(rèn)識新冠病毒的高傳染性和開發(fā)新型治療方法至關(guān)重要。大量研究表明新冠病毒S蛋白的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域 (receptor-binding domain, RBD) 比非典病毒S蛋白的RBD具有更高的ACE2親和性，并且包含一個(gè)非典病毒S蛋白不存在的蛋白酶Furin的位點(diǎn)，這些特征使新冠病毒能夠更高效的侵染宿主細(xì)胞[4,5]。張宏團(tuán)隊(duì)前期發(fā)表于Developmental Cell雜志上的研究發(fā)現(xiàn)，新冠病毒編碼的輔助蛋白ORF3a定位于晚期內(nèi)吞體/溶酶體上，通過阻斷自噬體與溶酶體的融合而抑制自噬活性，幫助病毒逃脫宿主細(xì)胞內(nèi)的自噬監(jiān)控。但非典病毒的ORF3a卻并不具備這樣的功能[6]。 

　　2021年10月10日，中國科學(xué)院生物物理研究所張宏課題組在Developmental Cell雜志在線發(fā)表了題為ORF3a of SARS-CoV-2 promotes lysosomal exocytosis-mediated viral egress 的研究論文。該文揭示了SARS-CoV-2編碼的輔助蛋白ORF3a通過招募BORC復(fù)合體和溶酶體外泌相關(guān)的SNARE蛋白而促進(jìn)溶酶體外泌，并發(fā)現(xiàn)了導(dǎo)致新冠病毒ORF3a和非典病毒ORF3a在溶酶體外泌和細(xì)胞自噬過程中起不同作用的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)。 

　　LAMP1是溶酶體膜蛋白，在溶酶體外泌過程中隨著溶酶體膜與細(xì)胞膜融合而定位于細(xì)胞膜表面[7,8]。該研究發(fā)現(xiàn)，與對照細(xì)胞相比，細(xì)胞質(zhì)膜定位的LAMP1在ORF3a表達(dá)細(xì)胞中明顯增加。這說明表達(dá)ORF3a能夠有效促進(jìn)溶酶體外泌。同時(shí)，介導(dǎo)溶酶體外泌的BORC復(fù)合體關(guān)鍵組分BORCS6，介導(dǎo)溶酶體膜與質(zhì)膜融合的SNARE組分VAMP7和STX4均能夠被ORF3a招募而形成大量點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)（圖1）。這些組分能夠與ORF3a直接相互作用且有明顯的共定位。在ORF3a表達(dá)細(xì)胞中敲減這些基因，能夠有效抑制細(xì)胞膜上LAMP1的異常增加。 

　　圖1. 新冠病毒的ORF3a促進(jìn)溶酶體外泌 

　　張宏團(tuán)隊(duì)之前的研究發(fā)現(xiàn)新冠病毒的ORF3a通過異常招募HOPS組分VPS39，從而抑制自噬體與溶酶體融合而導(dǎo)致自噬阻滯[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，被ORF3a招募到溶酶體上的VPS39促進(jìn)溶酶體外泌。敲減VPS39能夠明顯抑制OFR3a表達(dá)細(xì)胞中的溶酶體外泌（圖2）。VPS39與BORCS6和STX4有直接的相互作用。而敲減VPS39使ORF3a與STX4和VAMP7的結(jié)合明顯減弱。 

　　圖2. VPS39參與ORF3a介導(dǎo)的溶酶體外泌 

　　進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在新冠病毒侵染過程中，細(xì)胞膜定位的LAMP1也明顯增加。同時(shí)，在新冠病毒侵染的細(xì)胞中，VAMP7和STX4形成大量明顯的點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)（圖3）。缺乏ORF3a同源物的鼠肝炎病毒 (MHV) 也利用溶酶體外泌通路進(jìn)行病毒分泌[1]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在鼠17Cl-1細(xì)胞中表達(dá)新冠病毒的ORF3a，能夠有效增加細(xì)胞培養(yǎng)基中MHV的滴度。這說明表達(dá)ORF3a能夠促進(jìn)MHV從宿主細(xì)胞中釋放。 

　　圖3. 新冠病毒感染細(xì)胞中溶酶體外泌增強(qiáng)，VAMP7形成的點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)增加 

　　SARS-CoV-2編碼的ORF3a與SARS-CoV編碼的ORF3a具有高度同源性，其中約72%的氨基酸是相同的。張泓團(tuán)隊(duì)先前研究表明非典病毒編碼的ORF3a不能與VPS39相互作用，也不能阻滯細(xì)胞自噬[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，表達(dá)非典病毒的ORF3a也不能促進(jìn)溶酶體外泌。通過依次將新冠病毒ORF3a蛋白與非典病毒ORF3a不同的氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行突變，發(fā)現(xiàn)新冠病毒ORF3a蛋白的171位的絲氨酸(S)和193位的色氨酸(W)對于促進(jìn)溶酶體外泌和阻滯自噬至關(guān)重要。將非典病毒ORF3a蛋白的171位谷氨酸(E)和193位精氨酸(R)同時(shí)突變?yōu)橄鄳?yīng)位置新冠病毒ORF3a的氨基酸后，非典病毒的ORF3a便能夠與VPS39相互作用，并獲得阻滯細(xì)胞自噬和促進(jìn)溶酶體外泌的功能。有趣的是，果子貍冠狀病毒 (Civet SARS CoV 007/2004) 編碼的ORF3a在這兩個(gè)氨基酸位置上與非典病毒的序列相同，而蝙蝠冠狀病毒RaTG13 (Bat coronavirus RaTG13) 以及穿山甲冠狀病毒(Pangolin coronavirus) 編碼的ORF3a與新冠病毒在這兩個(gè)位置上的氨基酸相同（圖4）。 

　　圖4. 非典病毒ORF3a(E171S R193W)突變體能夠招募VPS39以及促進(jìn)溶酶體外泌 

　　該研究揭示了新冠病毒的ORF3a促進(jìn)溶酶體外泌。ORF3a能夠招募在溶酶體外泌中起重要作用的分子，促進(jìn)溶酶體向細(xì)胞膜方向運(yùn)輸并向細(xì)胞外分泌。非典病毒的ORF3a并不具有促進(jìn)溶酶體外泌和阻滯細(xì)胞自噬的功能。這項(xiàng)研究對于理解新冠病毒和非典病毒傳染性和致病性的差異，開發(fā)新的病毒治療方法提供了幫助。同時(shí)對于新冠病毒的起源研究也有一定的意義。 

　　圖5. 新冠病毒ORF3a促進(jìn)溶酶體外泌的模式圖 

　　該研究的通訊作者為中國科學(xué)院生物物理研究所的張宏研究員，第一作者為張宏組的博士后陳迪。該課題組主要從事多細(xì)胞生物自噬分子機(jī)制及生理功能的研究。 

   （來源：BioArt） 

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　　鏈接：https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S1534580721008078