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　　Src作為第一個被鑒定的癌癥基因，在癌細胞系和大量的病人腫瘤組織中都呈現(xiàn)出異常的表達和活性。Src的過度激活會促進腫瘤生長和癌細胞轉(zhuǎn)移，并且含有更高水平pSrc的組織會更容易表現(xiàn)出抗藥性。因此，能夠在活細胞中以超高的時空分辨率解析Src活性調(diào)控的動態(tài)過程，對于深入理解Src致癌的分子機制以及后續(xù)藥物的研發(fā)具有重要意義。 

　　生物傳感器（biosensor）可用來在時間和空間上定量研究生物分子的構(gòu)象或者活性動態(tài)變化�；铙w生物研究中常使用基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）的傳感器，但其靈敏度低。此外，傳感器的構(gòu)建通常利用某個識別特定構(gòu)象的蛋白片段。這些片段多來源于下游效應(yīng)器，其特異性差且會與內(nèi)源配體競爭，干擾正常的調(diào)控。 

　　2021年10月11日，University of North Carolina at Chapel Hill的Klaus M. Hahn和Timothy C. Elston團隊（共同一作為劉貝和Orrin J. Stone、Michael Pablo）在Cell上發(fā)表了文章Biosensors based on peptide exposure show single molecule conformations in live cells。作者們開發(fā)了binder/tag技術(shù)，可以通過簡單的蛋白質(zhì)工程學操作構(gòu)建靈敏的、適用于單分子追蹤的生物傳感器。新的傳感器不依賴于目標蛋白本身的氨基酸序列，且識別位點遠離蛋白本身的活性位點，因此其特異性好、干擾小，更適于推廣到其他蛋白的活性研究中。 

　　Binder/tag方法利用一對短肽（tag）和蛋白（binder）的特異性相互作用（圖1A）。作者們通過選擇tag的插入位點，在目標蛋白處于失活狀態(tài)時，tag被隱藏在蛋白內(nèi)部。目標蛋白被激活后，暴露出tag，進而binder能夠與tag相互作用（圖1B）。因此binder和tag的共定位即反映了靶標的激活狀態(tài)，或者特殊情況下可僅通過追蹤binder的定位來指示目標的激活狀態(tài)。Binder/tag的概念很容易推廣到其他蛋白上，文中同時闡釋了tagSrc，tagFyn，tagSyk以及tagFAK的構(gòu)建，并確定了另外一組短肽/蛋白對，以用來同時成像多種蛋白活性。 

　　圖1.（A) binder/tag利用僅有 7 個殘基的SsrA短肽和 18 kDa 的蛋白 SspB， 二者具有16 nM 親和力。(B)將binder/tag技術(shù)應(yīng)用于受自抑制調(diào)節(jié)的蛋白。 

　　Binder/tag也可用來構(gòu)建基于FRET的傳感器。在確定tag插入位點后， 只需將FRET對（例如CFP-YFP）分別融合在tagSrc和binder的末端。在單細胞中，作者發(fā)現(xiàn)Src僅在細胞伸展的時候被激活，而在收縮時瞬間失活（圖2）。 

　　圖2. 基于FRET的binder/tag傳感器在單細胞尺度上揭示細胞邊緣伸展-收縮過程中Src活性的動態(tài)變化。 

　　驅(qū)動細胞行為的機制通常是跨尺度的。作者們利用HaloTag和SNAP-tag在細胞內(nèi)通過熒光染料標記tagSrc和binder，進而在單分子尺度下追蹤Src分子的運動軌跡和構(gòu)象變化。利用Binder/tag，作者研究了Src在黏著斑（adhesion）上富集及激活的動態(tài)過程，并在納米尺度下揭示了蛋白質(zhì)簇（cluster）內(nèi)Src的構(gòu)象狀態(tài)及分布。最后，利用隨機建模，作者確定了單個Src分子激活的動力學（圖3）。 

　　圖3. （左）Src的豐度及活性隨著黏著斑的成熟而上升。（右）Binder/tag在單分子層面描繪了蛋白質(zhì)簇內(nèi)Src構(gòu)象的分布，并確定了單個Src分子上膜及激活的動力學過程。 

   （來源：BioArt） 

　　原文出處：Bei Liu, Orrin J.Stone, Michael Pablo, et al. Biosensors based on peptide exposure show single molecule conformations in live cells[J].Cell. Available online 11 October 2021. https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.09.026. 

　　鏈接：https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0092867421011090