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新型冠狀病毒感染引起的肺炎疫情至今仍在全球肆虐，且感染病例數(shù)在突破2000萬后仍在繼續(xù)攀升。經(jīng)過全國上下艱苦努力，我國新冠肺炎疫情防控向好態(tài)勢進(jìn)一步鞏固，為全面落實(shí)“外防輸入、內(nèi)防反彈”的總體防控策略，防控工作已從應(yīng)急狀態(tài)轉(zhuǎn)為常態(tài)化。

隨著各地新建符合安全級(jí)別的PCR實(shí)驗(yàn)室與核酸檢測技術(shù)的普及，病毒核酸檢測常態(tài)化已成為落實(shí)疫情常態(tài)化防控“四早要求”的首要措施與關(guān)鍵舉措。

新冠肺炎疑似病例的確診，須“具備以下病原學(xué)證據(jù)之一：

1. 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測，新型冠狀病毒核酸陽性；2. 病毒基因測序，與已知的新型冠狀病毒高度同源。

相比于病毒基因測序，病毒核酸檢測因更“接地氣”，也更容易更適合推廣，成為了目前診斷新型冠狀病毒肺炎的“金標(biāo)準(zhǔn)”。

當(dāng)遇到標(biāo)本采集的質(zhì)量、患者所處的病程及檢測試劑盒的靈敏度等因素可影響檢酸檢測結(jié)果。樣本采樣部位不佳、采樣量不足、保存不當(dāng)、病程早期病毒分泌量少及檢測試劑靈敏度不佳常導(dǎo)致新冠病毒核酸檢測的假陰性結(jié)果。但隨著大批量臨床樣本的實(shí)驗(yàn)室檢測不斷增多，除了此前多篇報(bào)道的“核酸檢測可能存在假陰性”外，“假陽性”也是一個(gè)不容忽視的問題。

為什么會(huì)出現(xiàn)假陽性的結(jié)果？如何判斷檢測結(jié)果是假陽性？我們應(yīng)該如何盡量降低或避免假陽性結(jié)果，保證核酸檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性呢？出現(xiàn)了假陽性該怎么辦？......

要知道以上“假陽性”的相關(guān)問題，我們可能要從PCR技術(shù)的原理聊起。

什么是熒光定量PCR？

首先給大家介紹一下臨床上用于新型冠狀病毒核酸檢測的實(shí)時(shí)熒光反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，也就是人們常說的PCR。

實(shí)時(shí)熒光RT（real-time）-PCR，即實(shí)時(shí)熒光反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。它首先將提取的病毒基因組RNA，通過反轉(zhuǎn)錄變成DNA（cDNA）。然后再用病原體特異性的引物，以cDNA作為模板擴(kuò)增病原體核酸序列。因?yàn)閿U(kuò)增的過程中熒光染料能同步整合在產(chǎn)物上，所以研究者可以通過熒光信號(hào)的強(qiáng)弱，進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測。

武漢市第四醫(yī)院檢驗(yàn)科核酸檢測PCR擴(kuò)增

實(shí)時(shí)熒光RT-PCR技術(shù)具有特異、快速、敏感、產(chǎn)率高、高通量、簡便等突出優(yōu)點(diǎn)，為人類疾病的防治提供新的檢測手段，已成為臨床實(shí)驗(yàn)室常用的操作技術(shù)之一。大多數(shù)病原體都可通過PCR檢測，除了新冠病毒外，還有乙肝病毒（HBV）、人乳頭瘤病毒（HPV）等，但在實(shí)際PCR實(shí)驗(yàn)過程中極易發(fā)生污染，引起檢測結(jié)果的假陽性。

什么是“假陽性”？

PCR反應(yīng)的最大特點(diǎn)是具有較大擴(kuò)增能力與極高的靈敏性，但作為一種高靈敏度的檢測手段，也是因?yàn)檫^于靈敏反而容易污染，PCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也容易被各種無關(guān)的外源性DNA或RNA所干擾，極其微量的污染也能擴(kuò)增后被檢出，即在本不該出現(xiàn)熒光信號(hào)的陰性樣本、陰性對照（生理鹽水）或空白對照中出現(xiàn)了陽性的熒光信號(hào)，可能造成假陽性的產(chǎn)生與陽性結(jié)果誤判。

引起PCR實(shí)驗(yàn)室污染的原因主要有哪些呢？

由于PCR技術(shù)敏感性特高，所以要求更高，影響因素也非常多，從樣品開始采集到結(jié)果報(bào)告發(fā)出，任何一處細(xì)小的失誤都會(huì)造成檢測結(jié)果的偏差，極其微量的污染都容易導(dǎo)致樣品出現(xiàn)假陽性結(jié)果。產(chǎn)生污染的主要途徑如下：

1、標(biāo)本的污染

（1） 收集標(biāo)本的容器被污染；

（2） 標(biāo)本放置的時(shí)候，由于密封不嚴(yán)溢于容器外；

（3） 容器外粘有標(biāo)本造成相互間交叉污染；

（4） 標(biāo)本核酸模板在提取過程中，由于加樣器污染導(dǎo)致標(biāo)本間污染；

（5） 有些微生物標(biāo)本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴(kuò)散，導(dǎo)致彼此間的污染。

武漢市第四醫(yī)院檢驗(yàn)科正在進(jìn)行核酸提取加樣

2、試劑的污染

主要是在PCR組分試劑配制加樣過程中，由于加樣器、容器、雙蒸水、陰性對照及其它試劑被PCR核酸模板或陽性對照污染。

3、擴(kuò)增產(chǎn)物污染

實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)增產(chǎn)物的遺留污染是PCR實(shí)驗(yàn)室中最主要、最常見的污染。因?yàn)?PCR 產(chǎn)物拷貝量大，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于 PCR 檢測數(shù)個(gè)拷貝的極限，所以極微量的 PCR 產(chǎn)物污染，就可形成假陽性。

氣溶膠污染是最可能造成PCR產(chǎn)物污染的主要原因。在離心機(jī)離心、空氣與液體面摩擦?xí)r、在操作時(shí)比較劇烈地?fù)u動(dòng)反應(yīng)管，開蓋時(shí)、吸樣時(shí)、閉蓋時(shí)，及污染加樣器的反復(fù)吸樣吹打都可形成氣溶膠而污染。當(dāng)這些氣溶膠里長短不一核酸片段的小顆粒在實(shí)驗(yàn)室里（或移液器內(nèi)）日積月累，沉降到實(shí)驗(yàn)臺(tái)面、PCR儀、移液器、吸頭盒等地方，當(dāng)達(dá)到一定濃度，很可能會(huì)彌漫到樣本中，最后導(dǎo)致PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)假陽性。

PCR實(shí)驗(yàn)室的污染應(yīng)急處理方法有哪些？

根據(jù)國務(wù)院應(yīng)對新型冠狀病毒肺炎疫情聯(lián)防聯(lián)控機(jī)制醫(yī)療救治組2020年7月10日發(fā)布的《醫(yī)療機(jī)構(gòu)新型冠狀病毒核酸檢測工作手冊》，PCR實(shí)驗(yàn)室的污染應(yīng)急處理方法如下：

1、標(biāo)本污染生物安全柜的操作臺(tái)造成局限污染時(shí)

立即用吸水紙覆蓋，并使用0.55%含氯消毒劑進(jìn)行噴灑消毒。消毒液需要現(xiàn)用現(xiàn)配，24小時(shí)內(nèi)使用。

2、標(biāo)本傾覆造成實(shí)驗(yàn)室污染時(shí)

保持實(shí)驗(yàn)室空間密閉，避免污染物擴(kuò)散。立即使用潤濕有0.55%含氯消毒劑的毛巾覆蓋污染區(qū)。必要時(shí)（如大量溢撒時(shí)）可用過氧乙酸加熱熏蒸實(shí)驗(yàn)室，劑量為2g/m3，熏蒸過夜；或20g/L過氧乙酸消毒液用氣溶膠噴霧器噴霧，用量8ml/m3，作用1-2小時(shí)；必要時(shí)或用高錳酸鉀-甲醛熏蒸：高錳酸鉀8g/m3，放入耐熱耐腐蝕容器（陶罐或玻璃容器），后加入甲醛（40%）10ml/m3，熏蒸4小時(shí)以上。熏蒸時(shí)室內(nèi)濕度60%-80%。

3、清理污染物時(shí)嚴(yán)格遵循活病毒生物安全操作要求

采用壓力蒸汽滅菌處理，并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室換氣等，防止次生危害。

有哪些措施能預(yù)防實(shí)驗(yàn)室污染，防止假陽性的產(chǎn)生呢？

1．布局合理的實(shí)驗(yàn)室是保證實(shí)驗(yàn)?zāi)苷�常進(jìn)行的前提

PCR實(shí)驗(yàn)室原則上至少設(shè)有試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣品制備區(qū)，擴(kuò)增區(qū)三個(gè)單獨(dú)的工作區(qū)域，并設(shè)有專用走廊，各工作區(qū)域應(yīng)設(shè)緩沖間。各區(qū)在空間上完全獨(dú)立，不能相通。各區(qū)有獨(dú)立的通風(fēng)系統(tǒng)，擴(kuò)增前和擴(kuò)增后區(qū)域應(yīng)具有獨(dú)立通風(fēng)系統(tǒng)，擴(kuò)增后區(qū)域保持負(fù)壓狀態(tài)，其它區(qū)域保持正壓或常壓狀態(tài)，防止擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)入擴(kuò)增前的區(qū)域，壓差≥5Pa。進(jìn)風(fēng)口和出風(fēng)口不能設(shè)在建筑的同一平面，要避免排出的空氣被重新吸進(jìn)實(shí)驗(yàn)室。

各區(qū)域只用于特定的操作，工作衣和清潔清毒物品不得跨區(qū)混用，實(shí)驗(yàn)室人員和物品應(yīng)從試劑準(zhǔn)備區(qū)到擴(kuò)增區(qū)單向工作流動(dòng)，不得逆向流動(dòng)。

某醫(yī)院PCR實(shí)驗(yàn)室平面圖設(shè)置

2．做好質(zhì)量控制

實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立合理、科學(xué)的室內(nèi)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP），質(zhì)控應(yīng)該樣本處理到報(bào)告發(fā)放全程參與，新型冠狀病毒核酸檢測嚴(yán)格執(zhí)行“三個(gè)陰性樣本隨機(jī)放在臨床標(biāo)本中間同時(shí)參與檢測全過程”的質(zhì)控策略，以及復(fù)檢規(guī)則的設(shè)置等，可有效避免假陽性結(jié)果的發(fā)生[1]。

3. 試劑耗材的擺放

配制試劑時(shí)應(yīng)正確使用加樣槍，使用帶濾心的槍頭，盡量一次性吸完，不要反復(fù)多次抽吸，以免交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠。核酸提取結(jié)束后，取下廢棄試劑和耗材，用自封袋密封后放入醫(yī)療廢物桶中。

帶濾心的槍頭

4. 核酸擴(kuò)增

擴(kuò)增產(chǎn)物是最容易出現(xiàn)的污染，通常一次典型的PCR擴(kuò)增可以產(chǎn)生109拷貝的靶序列，若氣溶膠化，最小的氣溶膠都會(huì)產(chǎn)生含106拷貝的擴(kuò)增序列，這些氣溶膠的累積會(huì)污染實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的試劑、儀器設(shè)備和通風(fēng)設(shè)備，使檢測結(jié)果出現(xiàn)異常[2]。因此，應(yīng)對核酸擴(kuò)增的每一個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行嚴(yán)格的規(guī)范操作。

（1）擴(kuò)增反應(yīng)液和樣本核酸模板分裝完畢檢查管內(nèi)液面高度一致后，加蓋八聯(lián)管蓋，逐孔按緊，混勻離心后再次檢查八聯(lián)管有無滲漏。

（2）八聯(lián)管轉(zhuǎn)移至96孔擴(kuò)增盤時(shí)再次確認(rèn)管蓋已封嚴(yán)，以防擴(kuò)增過程中爆管導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室污染。

將擴(kuò)增產(chǎn)物八聯(lián)管放入“自封袋”內(nèi)封嚴(yán)

（3）擴(kuò)增結(jié)束后要及時(shí)將擴(kuò)增產(chǎn)物從擴(kuò)增儀里取出（禁止打開八聯(lián)管），檢查管內(nèi)液面無變化后放入“自封袋”內(nèi)封嚴(yán)，然后帶出擴(kuò)增區(qū)，不能隨便丟棄，需按醫(yī)療廢物處理。

5。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后的清潔消毒

清潔消毒方法不當(dāng)也是實(shí)驗(yàn)室污染的一個(gè)主要原因，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后應(yīng)遵從先清潔區(qū)域后污染區(qū)域消毒的原則，及時(shí)對實(shí)驗(yàn)室空氣、設(shè)備表面、工作臺(tái)面和地面等實(shí)施有效的消毒。

（1）紫外燈

工作結(jié)束后用可移動(dòng)紫外線燈進(jìn)行工作臺(tái)面照射；

開啟超凈工作臺(tái)或生物安全柜內(nèi)的紫外線進(jìn)行照射；

夜間開啟固定紫外線燈進(jìn)行照射。

武漢市第四醫(yī)院檢驗(yàn)科核酸提取完照紫外消毒

（2）70%乙醇

每天工作開始前及工作結(jié)束后拭工作臺(tái)面、設(shè)備及物品表面；

日常儀器和架子的維護(hù)清潔。

（3）0.55%次氯酸鈉溶液（新鮮配置）

實(shí)驗(yàn)室工作臺(tái)面和樣本外濺時(shí)使用；

開蓋機(jī)、生物安全柜等日常擦拭。

（4）PCR Cleaner（ PCR污染清除噴霧劑）

PCR Cleaner（ PCR污染清除噴霧劑）是去除實(shí)驗(yàn)室操作臺(tái)表面DNA的即用型噴霧劑，用于去除PCR工作臺(tái)、實(shí)驗(yàn)室機(jī)電產(chǎn)品、試驗(yàn)臺(tái)表面和實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備表面上殘存的核酸，能快速有效地清除DNA或RNA污染，也是PCR實(shí)驗(yàn)室常見的污染清除利器之一。

另外，加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室通風(fēng)，真的非常重要�。。。�！

總結(jié)下來，

實(shí)驗(yàn)室防污染原則

預(yù)防為主，嚴(yán)守章程！